纳米氧化锆沉积棉花纤维的制备及其在磷酸化多肽快速富集中的应用

时间:2018-07-26 编辑整理:余琼卫,方凯敏,何小梅,郑杰,冯钰锜 来源:早发表网

摘要:采用液相沉积法在棉花纤维的表面成功沉积了纳米氧化锆颗粒,并将其装填在移液枪的吸头内,通过移液枪的抽吸实现对磷酸化多肽的萃取,萃取过程只需要2min,方法简单、快速。该材料不仅可以从β-酪蛋白酶解物这种简单的体系中萃取出9个磷酸化多肽,还可以从物质的量比为1:100的β-酪蛋白酶解物和牛血清白蛋白(BSA)酶解物混合物这类含有大量非磷酸化多肽的复杂样品中萃取出4种磷酸化多肽,且没有非磷酸化多肽被检出,表现出较好的萃取选择性。将该材料应用于人血清和脱脂牛奶这两种复杂实际样品的酶解物中磷酸化多肽的快速富集萃取,分别检测出5种和9种磷酸化多肽,均表现出较好的选择性。

关键词:氧化锆,纳米材料,液相沉积法,磷酸化多肽,富集

蛋白质的磷酸化是一种重要的可逆性翻译后修饰,参与诸多生理调控过程[1]。一般采用电喷雾质谱(ESI-MS)或基质辅助激光解吸质谱(MALDI-MS)对磷酸化蛋白的酶解产物进行检测,用于研究磷酸化的丰度、位点等。但是,由于磷酸化多肽在体内含量低,且所处基质复杂,难以直接进行质谱分析检测。因此,在质谱分析前,需对其进行纯化和富集[2,3]。目前应用最广泛的磷酸化多肽的富集方法主要是固载金属亲和色谱法[4-9]和金属氧化物亲和色谱法[10-15]。其中,金属氧化物亲和色谱法中已有多种金属氧化物(如TiO2、ZrO2、Al2O3等)被开发应用于磷酸化多肽的富集,但是由于金属氧化物表面性质的差异,它们对磷酸化多肽的选择性存在较大的差别[16,17],如ZrO2和TiO2,Zr和Ti在晶体中的配位数不同会导致它们对磷酸化多肽不一样的结合能力;不仅如此,采用不同方法制备得到的不同晶型的同种类型金属氧化物对磷酸化多肽也会有不同的选择性[18]。因此,磷酸化多肽预富集新方法及富集材料的开发一直是磷酸化蛋白质组研究的重要课题,具有重要意义。

 

同时加入它们的反应产物HF的消耗剂硼酸(H3BO3)或金属铝使金属氧化物薄膜沉积在基质表面。该方法操作简单、不受基底形状限制、制备过程中不需要热处理,并且不需要昂贵的设备,它是专为制备氧化物薄膜而发展起来的,因此被广泛应用于催化材料或电极材料等材料中功能性氧化物薄膜的制备。

基于LPD的特点,本课题组将该方法应用于分离介质材料的制备中[11,14,20-23],目前我们已采用LPD分别在毛细管和硅胶基质上沉积了纳米氧化钛、纳米氧化硅及纳米氧化镍等多种纳米氧化物涂层材料,目前还未见采用LPD制备的纳米氧化锆涂层应用于分离科学领域中的报道。

棉花作为一种丰富的天然生物材料,具有廉价、生物相容性好、稳定性好等特点,近年来被引入到分离科学领域,本课题组将进行功能化修饰后的棉花应用于一种微型化的SPE装置,即将功能化的棉花填装于注射器内或者移液枪的吸头中,从而对待分析物进行快速萃取[24-29]。因棉花的表面含有大量的羟基,可以作为液相沉积的基底。本工作采用液相沉积法制备了纳米氧化锆沉积棉花纤维(ZrO2-CF)材料,对材料进行了表征,并将其应用于磷酸化多肽的选择性富集。

1实验部分

1.1仪器、试剂与材料

冷冻离心浓缩仪(美国Labconco公司),扫描电镜(Quanta200,荷兰FEI公司)及其附带的能量色散型光谱仪(EDAXGENSIS,美国Ametek公司)。AximaTOF型MALDI-TOFMS仪(日本Shi-madzu公司)。

磷酸(H3PO4)、三氟乙酸(TFA)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)、β-酪蛋白(β-casein)、牛血清白蛋白(BSA)、碘乙酰胺(IAA)、二硫苏糖醇(DTT)、胰蛋白酶等购自美国Sigma-Aldrich公司。氟锆酸(H2ZrF6)购自阿拉丁公司。铝片购自国材科技有限公司。分析纯氨水、乙酸购自国药集团有限公司。脱脂棉花购买于徐州卫材有限公司。纯水使用Mil-lipore公司的Milli-Q装置(Bedford,美国)制备得到。脱脂牛奶购于武汉大学自强超市。血清是来自武汉大学校总医院健康人的血清,存放在-80℃冰箱中,备用。

 

1.3样品的制备

β-酪蛋白酶解物:采用100mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲溶液稀释β-酪蛋白配制1g/L的β-酪蛋白溶液,然后按照酶与β-酪蛋白质量比为1:50的比例在上述溶液中加入胰蛋白酶,将加入了酶的β-酪蛋白溶液在37℃下反应16h,β-酪蛋白溶液经酶解后得到的产物在真空离心浓缩仪中旋干,存放在-80℃冰箱中备用。

BSA酶解物:首先配制含8mol/L尿素的100mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲溶液,然后将1mgBSA加入到100μL上述缓冲溶液中,待BSA溶解后,再加入DTT(DTT终浓度为10mmol/L),放于37℃烘箱中反应30min,然后在上述溶液体系中继续加入IAA(IAA终浓度为20mmol/L),避光室温反应30min;之后,再加入300μL100mmol/LTris-HCl(pH8.5)稀释,按照酶与蛋白质质量比为1:50的比例加入胰蛋白酶,置于37℃烘箱中反应16h。酶解后的产物经真空离心浓缩仪旋干后存放于-80℃冰箱中备用。

脱脂牛奶酶解物:将100μL脱脂牛奶放在真空离心浓缩仪中旋干,然后加入100μL含8mol/L尿素的100mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲溶液复溶牛奶。剩余的步骤与BSA的酶解步骤相同。

1.4磷酸化多肽的富集过程

称取3mg的ZrO2-CF装填在200-μL吸头前端,控制材料填装的高度在4mm左右,将装填了ZrO2-CF的吸头装在移液枪上,通过移液枪的多次吸/推使用。

1.4.1多肽溶液的富集

先将移液枪吸/推20次50μL3%(体积分数,下文中若无特殊说明,均为体积分数)TFA水溶液-乙腈(50/50,v/v)对材料平衡处理,然后将50μL加入了多肽的3%TFA水溶液-乙腈(50/50,v/v)上样液进行上样,为使磷酸化多肽充分吸附在ZrO2-CF材料上,吸/推移液枪40次上样液,然后用50μL3%TFA水溶液-乙腈(50/50,v/v)清洗两次,每次吸/推移液枪30次,之后采用50μL5%的氨水进行解吸两次,两次各吸/推移液枪30次。将两次所得的解吸液合并,真空离心浓缩仪旋干。最后,用2μL的基质溶液(20g/L2,5-DHB于50%乙腈、1%H3PO4的水溶液中)对旋干的解吸液进行复溶,取1μL的复溶液点在质谱仪靶上进行MALDI-TOF2MS分析。

1.4.2血清中磷酸化多肽的富集

与1.4.1节方法基本一致,先将2μL血清样品用3%TFA水溶液-乙腈(50/50,v/v)稀释至50μL,再作为上样液进行上样,其他操作同1.4.1节。

1.4.3脱脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集

将2μL脱脂牛奶酶解物用3%TFA水溶液-乙腈(50/50,v/v)稀释500倍,取50μL的稀释液作为上样液,其他操作同1.4.1节。

1.5仪器分析条件

MALDI-TOF2MS分析时采用波长为337nm的氮气激光器,其脉冲宽度为3ns;采用20kV的加速电压,在正离子反射模式下进行检测。质荷比(m/z)扫描范围为1000~3500,每张谱图是500次激光扫描的平均结果。

2结果与讨论

2.1ZrO2-CF的表征

我们利用扫描电子显微镜(SEM)对棉花和ZrO2-CF的表面形貌进行了表征。结果如图1所示,相比于棉花(图1a),ZrO2-CF的表面出现了一层致密的纳米二氧化锆颗粒(图1b)。同时采用能量色散型光谱仪表征了棉花和ZrO2-CF表面元素的差异(图1c,1d),证明了ZrO2-CF表面ZrO2的存在。结果表明,ZrO2-CF中Zr的含量为5.59%(图1d)。

 

2.2ZrO2-CF对磷酸化多肽的富集性能考察

2.2.1萃取条件的优化

多肽混合物中除含有磷酸化多肽外,还含有大量的非磷酸化多肽,在一定的酸度条件下,含有羧酸根等基团的非磷酸化多肽也会与氧化锆产生路易斯酸碱作用,从而干扰磷酸化多肽的富集,因而需对上样溶液的酸度进行优化。我们将ZrO2-CF用于β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物(物质的量比为1:10)混合样品的磷酸化多肽的富集分析研究。上样液中有机相为50%乙腈时,考察水相中不同体积分数的TFA对多肽混合物萃取效果的影响。当上样液的水相中TFA的体积分数为5%时,非磷酸化多肽的信号较1%TFA和3%TFA时的弱,但信噪比较低;上样液的水相中TFA含量为1%时,磷酸化多肽的信噪比较高,但是由于溶液的酸度较低,所以羧酸根等离子也被电离,也与纳米氧化锆产生路易斯酸碱作用,因而非磷酸化多肽的信号也较高,综合比较,最后选择3%TFA水溶液作为上样液的酸度条件。

仍然将β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物(物质的量比为1:10)混合样品作为考察对象,固定上样液的酸度为3%TFA,考察上样液中乙腈含量对萃取效果的影响。如图2所示,上样液中含有20%乙腈或者80%乙腈的时候,解吸液谱图中都含有大量的非磷酸化多肽(图2a,2c),而上样液中乙腈的含量为50%时,解吸液谱图中的非磷酸化多肽比较少,磷酸化多肽的峰较为明显(图2b)。图中标有数字的峰为磷酸化多肽信号峰,所标的数字为对应磷酸化多肽的质荷比(m/z)。这可能与磷酸化多肽与大部分非磷酸化多肽的疏水性不同有关。故选择50%乙腈作为上样液的有机相。

综上,选择3%TFA水溶液-乙腈(50/50,v/v)作为上样液。采用填装了3mgZrO2-CF材料的吸头对3pmol溶解于3%TFA水溶液-乙腈(50/50,v/v)的β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽进行萃取,将萃取后的萃余液用MALDI-TOF2MS进行分析,发现萃余液中无磷酸化多肽信号,表明ZrO2-CF对3pmolβ-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽萃取没达到吸附饱和,满足少量生物样品分析。

 

2.2.2萃取性能的考察

分别采用ZrO2-CF和未修饰的棉花纤维CF对β-酪蛋白酶解物(3pmol)进行萃取分析,考察它们对磷酸化多肽的富集能力。如图3a所示,当β-酪蛋白酶解物未经材料富集直接进行MALDI-TOF2MS检测分析时,虽然可以检测到4个磷酸化多肽的信号峰,但是谱图中还有大量非磷酸化多肽的信号峰,并且检测到的磷酸化多肽的信号都较弱。而经ZrO2-CF富集后,萃余液(图3b)中几乎看不到磷酸化多肽的峰,表明ZrO2-CF材料对磷酸化多肽具有较强的作用,解吸液(图3c)中可以看到9个磷酸化多肽的峰,几乎看不到非磷酸化多肽的峰,说明在用ZrO2-CF处理后能有效地去除大部分的非磷酸化多肽,表明材料对磷酸化多肽有较好的萃取选择性。然而用未修饰的棉花富集β-酪蛋白酶解物后的解吸液中只能检测到1个磷酸化多肽(图3d),表明CF表面沉积的纳米ZrO2颗粒对磷酸化多肽具有较好的选择性作用。

 

为了进一步考察ZrO2-CF对磷酸化多肽的萃取选择性,将它用于β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物不同比例混合后的磷酸化多肽的富集。如图4所示,酶解物混合后未经富集直接进行质谱分析时,谱图中无法观察到磷酸化多肽的信号(图4a,4b,4c),基本上都是非磷酸化多肽的信号峰,说明非磷酸化多肽严重干扰了磷酸化多肽的质谱分析,因此质谱检测磷酸化多肽前需将其选择性地从复杂样品图5血清酶解物和脱脂牛奶酶解物直接进样和经ZrO2-CF富集后的MALDI-TOF2质谱图Fig.5MALDI-TOF2massspectraoftrypticdigestofhumanserumandnon-fatmilkobtainedbydi-rectanalysisorafterenrichmentwiththeZrO2-CFa,b:trypticdigestofhumanserumobtainedby(a)directanalysisand(b)afterenrichmentwiththeZrO2-CF;c,d:trypticdigestofnon-fatmilkobtainedby(c)directanalysisand(d)afterenrichmentwiththeZrO2-CF.中萃取出来。图4d、4e和4f分别为1:1、1:10、1:100(物质的量比)的β-酪蛋白和BSA酶解物的混合物经ZrO2-CF富集后质谱检测的谱图,可以看出,当β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的比例为1:1时,经材料处理后能观察到5个磷酸化多肽的信号峰;当其混合比例提高到1:10,ZrO2-CF富集后的溶液能仍观察到5个磷酸化多肽的信号峰;而当其比例达到1:100后,ZrO2-CF富集后的溶液依然能观察到4个磷酸化多肽的信号峰,且3个比例的酶解混合物经ZrO2-CF富集后的质谱图中基本上看不到非磷酸化多肽的峰。以上结果表明,ZrO2-CF可以有效地从多肽混合物中选择性地萃取磷酸化多肽。

 

为考察方法的灵敏度,将ZrO2-CF用于β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽的萃取,当β-酪蛋白的浓度低至10fmol时,其酶解物经过ZrO2-CF富集后仍然可以检测到m/z3122的信号,这说明方法灵敏度高。

2.3ZrO2-CF材料对血清和牛奶中磷酸化多肽的富集应用

由于磷酸化多肽与人类疾病有着密切关系,人血清中内源性磷酸化多肽的测定受到越来越多的关注。由于血清样品含有大量蛋白质、多肽等复杂成分,对其中的磷酸化多肽进行分析仍是一项挑战性的工作。将血清样品稀释后,未经材料富集直接进行质谱分析时,如图5a所示,谱图中没有磷酸化多肽的信号;而在经ZrO2-CF富集后,如图5b所示,解吸液的质谱图中可看到4个磷酸化多肽的信号峰,它们的序列信息分别为DSGEGDFLAEGGGV(m/z1389.5)、ADSGEGDFLAEGGGV(m/z1460.5)、DSGEGDFLAEGGGVR(m/z1545.5)和ADSGEGDFLAEGGGVR(m/z1616.5)。

为了进一步证明ZrO2-CF对复杂样品中磷酸化多肽的萃取能力,将脱脂牛奶的酶解产物作实际样品,继续考察ZrO2-CF从实际样品中捕获磷酸化肽段的选择性。牛奶中含有大量的蛋白质和碳水化合物,基质非常复杂,当将脱脂牛奶酶解物直接经MALDI-TOF2质谱分析时,如图5c所示,仅有6个标示的谱峰为磷酸化多肽的信号峰,且信号较弱,谱图中大多数是非磷酸化多肽的信号峰;然而经过ZrO2-CF富集后,如图5d所示,非磷酸化多肽被有效去除,有9个磷酸化多肽被检测到且信号得到极大的提高,这9个被检测到的磷酸化肽段分别为β1(FQSEEQQQTEDELQDK,m/z2061.5)、β2(FQ-SEEQQQTEDELQDKIHPF,m/z2556.8)、β3(RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR,m/z3122.1)、α1(TVDMESTEVFTK,m/z1466.3)、α2(TVDM-ESTEVFTKK,m/z1594.4)、α3(VPQLEIVPN-SAEER,m/z1660.4)、α4(YLGEYLIVPNSAEER,m/z1832.6)、α5(DIGSESTEDQAMEDIK,m/z1927.4)、α6(YKVPQLEIVPNSAEER,m/z1951.7)和α7(FPQYLQYLYQGPIVLNPWDQVKR,m/z3024.9)。

 

以上实验结果表明,ZrO2-CF可以从复杂的实际样品中高选择性地萃取磷酸化多肽,与文献报道的萃取材料相比(见表1),ZrO2-CF与其他材料对磷酸化多肽的富集灵敏度基本相当,但是材料的制备方法及萃取方式更简单,适用于少量样品的磷酸化多肽的快速萃取分析。

 

 


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