摘要:建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-timePCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μLBst2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×102CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1000倍,与real-timePCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×102CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。
关键词:沙门菌,invA基因,环介导等温扩增技术,可视化检测
在最新的研究报告中,由沙门菌引起人食物中毒的病例居于首位,其中肠炎沙门菌占85%以上,据不完全统计,全球每年报道的沙门菌食物中毒的病人大约为170万人,死亡人数大约在1000人以上,且呈上升趋势[1],对公共卫生安全构成威胁。由此造成的医疗费用每年约114亿美元,给各国政府带来了巨大的经济负担[2]。因此,迫切需要建立一种快速、准确诊断沙门菌食物中毒的方法
目前,对沙门菌的检测方法主要有传统的分离鉴定方法、免疫学方法及分子生物学方法。传统的沙门菌检测方法是根据国家标准(GB4789.4-2016)进行的,其步骤比较繁琐,耗时较长,至少需要4d~7d才能得出明确的诊断结果,虽然此方法为“金标准”,但已不能满足实际工作的需要。免疫学方法主要利用抗原-抗体之间的特异性反应,是一种定性或定量的诊断技术,其灵敏性和特异性比较高,但其操作复杂、试验条件要求高等因素,在临床应用上带来了较大的不便。分子生物学方法需要昂贵的仪器设备,且受人为操作技术影响较大,不能区别核酸来源于死菌还是活菌,在基层单位也很难普及和推广应用[3-7]。NotomiT等[8]研究者开发了一种环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP),具有灵敏度高、特异性好、操作简单和方便快捷等优点,其扩增原理是利用一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶,该酶具有5′→3′聚合酶活性,可以针对特异性靶基因序列上的6个不同区域的4条引物和环引物,在简单的恒温装置上即可快速实现扩增核酸的方法。LAMP扩增产物可以通过借助浊度仪、电泳及在反应管中加入荧光染料进行结果判断[9-10],检测时间在60min左右,与常规PCR方法[11-12]相比,克服了重复的热变性并缩短了反应时间,且灵敏度和特异性在一定程度上也得到了很大的提高,具有良好的应用前景和发展潜力[13]。研究发现,invA基因是沙门菌重要的毒力因子,参与大多数沙门菌的入侵,并与致病性密切相关。在所有沙门菌侵袭机体的过程中,invA基因在毒力岛SPI-1的侵袭功能上发挥不可替代的作用,同时也是沙门菌的主要标记基因之一,该基因在沙门菌属中的同源性高达99%以上,且与其他物种同源性较小[14]。
本研究根据沙门菌invA靶基因的保守区域设计LAMP引物,优化检测条件,建立一种切合实际的沙门菌LAMP检测方法。通过对感染鸡白痢沙门菌的病鸡进行剖检,采集的脏器组织和人工污染沙门菌的鱼粉作为样品,用建立的沙门菌LAMP可视化检测方法与常规PCR和real-timePCR方法进行检测,评价其检出率和灵敏度,旨在建立一种特异性强、敏感性高和操作简便的沙门菌LAMP检测方法,为沙门菌病原的快速检测提供一种更便捷、可靠和适合基层的临床应用技术。
1材料与方法
1.1 材料
1.2
1.1.1 试验菌种及来源肠炎沙门菌(CVCC3949)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心;多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、链球菌、无乳链球菌、变形杆菌、痢疾杆菌、单核细胞增生李斯特菌和放线杆菌均由石河子大学微生物教研室保存。
1.1.2 主要仪器与试剂紫外凝胶成像分析系统,MolecularImager公司产品;超级恒温水浴锅,常州金坛精达仪器制造有限公司产品;Nanodrop-2000微量核酸蛋白检测仪,美国ThermoScientific公司产品;LightCycler®480II实时荧光定量PCR系统,罗氏公司产品;细菌基因组DNA提取试剂盒、2×ESTaqMasterMix、dNTP混合液,上海生工生物工程技术服务有限公司产品;Bst2.0DNA聚合酶大片段(M0538),NewEnglandBiolads(Beijing)有限公司产品;钙黄绿素、甜菜碱、MgSO4,Sigma公司产品。
1.1 方法
1.1.1 引物及探针的设计与合成根据NCBI中GenBank公布的沙门菌invA基因(登录号:NC003197.1),并用生物学在线软件分析该基因的保守核苷酸序列。针对invA基因的保守区域,结合环介导等温扩增方法的引物设计原则,利用PrimerExplorerV3(http://primerexplorer.jp/e/)在线引物设计软件筛选出一套特异性较好的引物(图1);根据real-timePCR引物和探针的设计原则,利用BeaconDesigner软件设计1对引物和探针,预期扩增片段大小为278bp。试验所用得引物和探针见表1,均有SangonBiotech(Shanghai)Co.Ltd合成。
1.1.2 细菌培养和DNA模板制备将试验涉及的沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、无乳链球菌、单核细胞增生李斯特菌和放线杆菌分别划线接种于LB或血液固体培养基,放到37℃培养箱里,培养16h~24h,挑取单个菌落于LB或血液培养液里,在37℃、180r/min条件下,振荡培养16h~48h后,平板涂布培养法对各培养物进行细菌计数,调整菌液浓度至1.0×108CFU/mL,然后按10倍梯度稀释,其浓度分别为1.0×108CFU/mL~1.0×101CFU/mL等8个不同浓度的菌液。分别取不同浓度的菌液1mL按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤,提取细菌基因组DNA,作为LAMP、PCR及real-timePCR反应模板,于-20℃保存备用。
1.1.3 LAMP检测方法的建立及反应条件优化根据文献[15],初步确定LAMP反应体系和反应条件,建立沙门菌LAMP检测方法。反应体系为:2.5μL10×ThermoPol缓冲液,1.5μLMgSO4,3μL引物(包括内引物(20μmol/L)、外引物(10μmol/L)和环引物(15μmol/L)各1μL),3.5μLdNTPs,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μLBst2.0DNA聚合酶,2μL模板,1μL钙黄绿素,最后加ddH2O水补足25μL;同时设置1个空白对照,用水替代模板。放入60℃恒温水浴锅扩增1h,80℃5min使酶失去活性。取5μL的扩增产物进行30g/L琼脂糖凝胶电泳判断结果。在此反应体系和条件的基础上对内外引物浓度比例、dNTPs体积、Mg2+浓度、反应温度和扩增时间进行优化,其中内外引物的比例分别为5∶1、4∶1、3∶1、2∶1;dNTPs的体积为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5μL;MgSO4分别为1.0、1.5、2、2.5、3.0、3.5μL;反应温度为54、56、58、60、62、64℃;扩增时间为30、40、50、60min。LAMP反应条件和体系都在前一步优化的基础上进行反应,取5μL扩增产物进行30g/L琼脂糖凝胶电泳检测,确定最佳的反应体系和条件。最后,通过电泳方法和荧光染料方法进行判定,确定最佳条件和体系。
1.1.4 沙门菌LAMP的特异性和重复性试验按照上述1.2.3优化的LAMP反应条件和体系,分别以提取的肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、链球菌、无乳链球菌、变形杆菌、痢疾杆菌、单核细胞增生李斯特杆菌和放线杆菌等11种食源性致病菌的DNA为模板进行扩增,产物用30g/L琼脂糖凝胶电泳检测。同时,用建立的LAMP方法,以提取的肠炎沙门菌为模板进行扩增,至少重复3次,已确定建立的检测方法的重复性。
1.1.5 LAMP、常规PCR和real-timePCR方法的灵敏度比较以肠炎沙门菌不同培养物(1.0×108CFU/mL~1.0×101CFU/mL)所对应的DNA为模板,空白对照用水代替。利用上述1.2.3优化的反应体系和反应条件进行LAMP扩增,反应产物通过电泳或钙黄绿素可视化检测,进行方法的灵敏度试验。以invAF和invAR为上、下游引物进行PCR反应,PCR反应体系20μL,包括2×ESTaqMasterMix10μL,上、下游引物invAF和invAR各0.3μL,模板2μL,ddH2O7.4μL;PCR反应程序为:95℃5min;95℃40s,59℃30s,30个循环;72℃1min50s。扩增产物分别进行电泳,根据目的条带的亮度判断其灵敏度。在常规PCR引物基础上增加1个水解探针,进行real-timePCR反应,反应体系10μL:包括2×PCRMasterMix5μL,上、下游引物invAF和invAR各0.2μL,探针0.2μL,模板1μL,ddH2O3.4μL;反应条件为95℃5min,94℃15s,58℃30s,72℃10s,同时捕捉FAM信号,进行45个循环。根据实时荧光定量PCR扩增的标准“S”形曲线而变化的荧光信号强度,求出Ct值,然后把Ct值带入标准曲线就可以计算出该样品检测的起始浓度。
1.1.6 沙门菌病原人工污染的鱼粉及临床样品检测取经检测未被沙门菌污染的鱼粉(10g)9份,取1.2.2稀释好的不同浓度的肠炎沙门菌菌液(1.0×108CFU/mL~1.0×101CFU/mL)1mL,与鱼粉匀浆液等体积混匀,其中阴性对照用PBS代替菌液。按照细菌基因组提取试剂盒说明提取细菌核酸,利用Nanodrop-2000微量核酸蛋白检测仪测定其浓度,各取2μL作为LAMP、PCR和real-timePCR方法检测时的模板。
为了评价所建立的LAMP检测方法的优势,对新疆某种鸡场有一定沙门菌病临床症状的25只病鸡,用平板凝集试验方法进行初筛,结合细菌分离鉴定方法进行确诊。剖检后取肝脏、脾脏和肠内容等样品,并对这些样品进行病原分离鉴定,同时用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取这些组织的核酸。分别进行LAMP、PCR和real-timePCR检测,比较3种方法的检出率,并与病原分离的结果进行比较。
2结果
2.1沙门菌LAMP检测方法的建立
以提取的肠炎沙门菌(浓度为1.0×105CFU/mL)DNA为模板,进行LAMP反应,其产物进行荧光染料显色观察和30g/L琼脂糖凝胶电泳分析。阳性结果荧光染料显色呈绿色,而空白对照为橙黄色(图2A)。琼脂糖凝胶电泳可见明显的特异性大小不一的梯形条带(图2B),而空白对照无梯形条带。结果表明,所建立的LAMP方法扩增的梯形条带为肠炎沙门菌invA的基因片段.。
2.2LAMP扩增最佳反应条件的确定
当内外引物浓度比例为3∶1(图3A)时,目的条带最亮;通过对反应试剂中加入的不同dNTPs和MgSO4的体积进行摸索,最终确定dNTPs为3.5μL(图3B),MgSO4为1.5μL(图3C),扩增温度为62℃(图3D),其LAMP扩增效率最佳,呈现典型的梯形条带;同时对反应的时间进行优化结果表明,当扩增反应时间在40min时,即可以出现明显的梯形条带,50min时条带几乎没有任何的变化趋于饱和(图3E),而在试验检测时可能会遇到样品模板浓度较低的情况,为了确保在较低浓度的沙门菌病原作为模板进行检测时,依然可以扩增出条带,因此确定最佳的反应时间为50min。通过对反应体系和条件优化,最终确定25μL的最佳反应体系为:2.5μL10×ThermoPol缓冲液,1.5μLMgSO4,4μL引物(包括内外引物比例为2∶1和环引物为1μL),3.5μLdNTPs,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μLBst2.0DNA聚合酶,2μL模板质粒,1μL钙黄绿素,最后加ddH2O水补足25μL;混匀并简短瞬离后,在60℃恒温水浴条件下扩增50min后,80℃5min使酶失去活性。
2.3LAMP检测方法的特异性和重复性试验
采用已经优化好的沙门菌LAMP反应体系和条件,对11株试验菌株进行LAMP扩增,来确认方法的特异性。图4电泳结果显示,只有沙门菌有预期的特征性梯形条带,而其他非沙门菌均没有条带,此方法的特异性较好。以沙门菌基因组DNA为模板进行多次重复试验,LAMP产物电泳结果均为阳性,空白对照结果为阴性,表明该方法重复性较好(图5)。
2.4LAMP、PCR和real-timePCR灵敏度比较
以提取的不同浓度的肠炎沙门菌基因组为模板,进行LAMP反应,肉眼可视化和电泳检测发现(图6A和6B),其最低检测浓度为1.0×102CFU/mL;而PCR最低可检测到1.0×105CFU/mL(图6C)。real-timePCR最低可检测模板的浓度为1.0×101CFU/mL,比LAMP方法灵敏度高1个数量级(图6D)。结果表明,建立的沙门菌LAMP方法的灵敏度与real-timePCR方法的灵敏度基本相当,比常规PCR方法高1000倍。
对临床疑似沙门菌病的病鸡,解剖后取肝脏、脾脏和肠内容物等共获的75份可疑病料。传统的细菌分离方法结果显示(表4)49份为阳性,26份为阴性,阳性率为65.4%;应用PCR检测方法得到阳性46份,阴性为29份,阳性率为61.3%;而LAMP技术和real-timePCR方法的检测结果一致,其阳性率为65.4%。说明LAMP检测方法对临床样品的检出率比常规PCR方法的高,与传统的细菌分离结果相符。3种方法检测结果与国家标准方法(GB4789.4-2016)检测结果的符合率分别为100%、93.7%、100%,LAMP检测方法的临床检出率比常规PCR方法的要高。
3讨论
沙门菌可以引起不同动物的多种多样的急性和慢性疾病,给人类经济和公共卫生造成了巨大的威胁。据美国疾病控制和预防中心(CDC)报告,美国公民每年由于感染沙门菌病而住院的病人达到1.5万多人,其中400多人死亡,而大多数感染者为老人和幼龄儿童;而这些食物中毒病例中大多数源于食用了污染沙门菌的禽产品和牛奶[15]。因此,在食品安全或者沙门菌食物中毒的临床诊断中,非常有必要建立一种快速、可靠和高灵敏的沙门菌检测方法。
本研究以沙门菌的invA为靶基因,利用软件设计了两对引物和一个环引物,建立了一种快速、高效检测沙门菌的LAMP方法,该方法操作简单,可目视化,通过电泳和荧光染料等途径都可以判定结果。其优点是其他分子生物学方法不可替代的,用该方法对临床样本的检测结果与行业内标准方法的检出率一致;对人工污染的鱼粉样品检测的灵敏度为5.0×102CFU/mL,比常规PCR方法高1000倍,比real-timePCR方法检测灵敏度结果低一个数量级,这可能是real-timePCR的引物设计增加了一个特异性的水解探针的缘故[11];但荧光定量PCR对试验技术和条件要求相对较高。LAMP技术的核心环节是引物设计、稳定的反应体系和反应条件以及操作加样无菌区域的控制。引物必须同时满足特异性好和高度保守的核苷酸特异性区域,是保证LAMP检测方法成功与否的一个关键因素。而本研究选择的靶基因invA高度保守,国内外学者利用该基因,设计PCR和LAMP特异性引物的相关研究报道比较多。KokkiosPA等[16]学者建立了LAMP方法用于检测食品中沙门菌的含量;AbdelazizNM等[17]建立PCR方法检测鸡肉中沙门菌,以上两种方法都是以高度保守的invA基因为检测靶标。本试验对LAMP反应组分中的Mg2+浓度、dNTP浓度、扩增温度和反应时间等都进行了优化,确定了最佳的反应体系和反应条件。LAMP扩增反应效率较高,当反应液中加入钙黄绿素后,有扩增产物时为绿色,反之,为橙黄色。另外,在对临床采集的75个样本(阴性26个)进行检测时,发现所建立的LAMP方法的检出率与常规的细菌分离鉴定方法一致。
目前,判定某种检测方法的优劣主要从灵敏度、操作方便和实用性这3个指标去衡量,能否在基层推广应用也是重要因素。传统的检测方法是基于微生物学知识,通常需要增菌培养,得出确切的诊断结果至少需要1周左右。就目前对沙门菌病诊断技术的研究趋势来看,其检测方法的研究方向主要围绕经济和高效这两个方面。而当前的分子生物学检测方法主要包括PCR、real-timePCR、套式PCR及PCR-基因芯片等方法,都具有较高的灵敏度和精确度,但需要借助昂贵的仪器设备和专业的技术人员操作等,一般的基层单位很难满足[18-20]。ChenZ等[21]基于沙门菌的目标invE基因和3个血清型特异性的基因(flic、lygD和STM4495)建立了LAMP技术,最低可检测出2.0×101CFU/mL沙门菌,而常规PCR方法的最低检测限为2.33×103CFU/mL。本研究建立的沙门菌LAMP方法其灵敏度为1.0×102CFU/mL。LessD等[22]利用免疫胶体金技术原理,建立了一种环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测ZiKa病毒的方法,该方法无需电泳,35min内肉眼直接可以读出结果,其灵敏度高,对于2μL的LAMP反应产物作为样品,其最低可检测到单个拷贝数。但目前该方法仅局限于血液样本的检测。WangD等[23]应用氧化还原反应建立了快速检测沙门菌的电化学方法,其最低检测限为7.6×102CFU/mL~6.0×102CFU/mL。WuGP等[24]将LAMP技术与荧光定量PCR方法结合,结合各自方法的优缺点并进行改善,建立了一种RtiLAMP方法应用于食物表面沙门菌检测,最低可以检测出6CFU/2.5μL(模板),整个反应在3.5h内就可以完成。YangQ等[25]建立的LAMP-BART技术,需要在反应体系中加入特定的荧光素酶,其数据处理复杂,反应时间较长,容易出现假阳性结果,应用于食品和饲料样品的检测,其灵敏度达到了104CFU/25g~106CFU/25g样品。本研究建立的可目视化LAMP方法,增加了一条环引物,提高了扩增效率,缩短了反应时间,扩增反应在1h内就可以完成,其灵敏性和特异性比较好;并且整个反应结束后,无需开盖通过颜色变化即可判断结果,避免了二次污染产生的假阳性问题。
本研究以沙门菌高度保守且特异性较强的invA基因为检测靶标,建立的可目视化环介导等温扩增方法具有特异性强、敏感度高和结果可目视等优点,可以在62℃恒温条件下,60min内完成对沙门菌的检测,对仪器和试验条件要求比较低,其灵敏度可以达到1.0×102CFU/mL,该方法对于沙门菌的临床检测、食品安全和公共卫生机构监控提供了一个有效的现场检测技术保障。
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