摘要：为了研究云芝(Trametesversicolor)发酵液中01．一半乳糖苷酶的生理生化性质，并筛选提高该酶稳定性的共溶剂，将d一半乳糖苷酶在不同pH缓冲液、不同反应温度、不同金属离子溶液以及不同保护剂中孵育一定的时间，并测定酶活。结果表明，d一半乳糖苷酶的最适反应pH为3．0，最适反应温度为600C；金属离子pb2+和Fe¨对酶活性有较强的抑制作用，并随着浓度的升高抑制作用有所增强，Cd2+、cu“和H92+致使仅一半乳糖苷酶的活性降低20％～50％，Ca“、M矛+、Zn“和Fe“等离子对该酶的活性影响不明显；保护剂筛选结果显示，2mmol·L。甘露醇对该酶热稳定性的保护效果最好，其次是海藻糖、蜜二糖、棉籽糖、L一半胱氨酸、甘油和黄原胶等。
关键词：云芝,d一半乳糖苷酶,酶学特性,共溶剂
Or--半乳糖苷酶(仅一galactosidase，EC3．2．1．22)也称蜜二糖酶，是1种外切水解酶，可催化水解非还原性末端以Ot一1，6键结合的半乳糖苷化合物…，可用于水解豆科植物中d一半乳糖苷低聚糖，消除豆类制品中由此引起的抗营养因子，促进其他营养物质的消化和吸收，目前广泛应用于饲料业、食品业、医药工业等领域121。仪一半乳糖苷酶大量分布于植物、微生物和动物中，由于来源不同其理化性质差异也较大131。因此，为保证获得高活性和高稳定性的ot一半乳糖苷酶，需要研究一些外在因素对该酶的影响，如最适pH和最适反应温度等，并尽量提高酶活稳定性，确保后期应用到食品、饲料等领域中时可以稳定食用。本文研究云芝(Trametesversicolor)发酵液中OL一半乳糖苷酶的理化性质，并筛选提高其酶活稳定性的共溶剂，为该酶制剂的有效生产和应用提供理论依据。
1材料和方法
1．1菌种与试剂
云芝菌种来自于陕西省微生物研究所微生物资源中心第三研究室；底物对硝基苯基仪一D一吡喃半乳糖苷(pNPG)购自Sigma公司(N0877)；其它试剂均为分析纯。
1．2培养基
斜面培养基：综合PDA；种子培养基：豆粞粉2％、KH：PO。O．1％；发酵培养基：豆粞粉2％、半乳糖1％、MgS040．1％、KHzP040．05％。
1．3云芝液体发酵
1．3．1液体种子培养
250mL三角瓶装入50mL液体种子培养基，加入10粒～15粒玻璃珠，高压灭菌后接人云芝斜面菌种，于26℃、180r·min。1振荡培养5d，获得云芝液体菌种。
1．3．2液体发酵培养
250mL三角瓶装入50mL液体发酵培养基，高压灭菌后接入3％(秽·秽一)的云芝液体菌种，于260C、180r·min一振荡培养7d，获得云芝发酵液。
1．4a一半乳糖苷酶活性的测定
1．4．1粗酶液的制备
将云芝发酵液用高速冷冻离心机离心10min得上清液，发酵菌丝球经研磨后低温抽提2h，离心后得上清液，将2次离心获得的上清液合并即为粗酶液。
1．4．2酶活测定
吸取0．1mL适当稀释后的粗酶液，再加入浓度为10mmol·L一的底物对硝基苯基仅一D一吡喃半乳糖苷0．1mL，于40℃恒温振荡反应10rain，加入0．8mL的Na：CO，溶液振荡混匀，终止酶反应，于波长405nm处测定吸光值。
酶活力单位定义：在一定条件下，每分钟生成lp．mol对硝基苯酚的酶量为1个酶活力单位(U)[41。
1．5仅一半乳糖苷酶理化性质的测定
1．5．1最适pH和pH稳定性的测定
最适pH的测定：配制不同pH的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液(pH分别为2．0，3．0，4．0，5．0，6．0，7．0、8．0)，测定仅一半乳糖苷酶在不同pH缓冲液中的酶活，将酶活力最高值计为100％，计算各pH下的d一半乳糖苷酶相对酶活，并绘制酶活变化曲线。
pH稳定性的测定：将适当稀释的酶液与不同pH的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液在常温下孵育2h，测定a一半乳糖苷酶活性，测得的最高酶活值计为100％，计算不同pH下的酶活存留率。
1．5．2最适反应温度和温度稳定性的测定
最适反应温度的测定：在不同温度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下反应，然后测定d一半乳糖苷酶活性，测得的最高酶活值计为100％，计算不同反应温度下仅一半乳糖苷酶的相对酶活，并绘制酶活变化曲线。
温度稳定性的测定：将适当稀释的酶液分别在不同温度下孵育2h，在最适反应温度下进行酶活性测定，以未保温(4℃)时测得的酶活值计为100％，计算不同反应温度下的酶活存留率。
1．5．3金属离子对仪一半乳糖苷酶滑陛的影响
使用去离子水配制20mmol·L‘1的K+、ca2+、Cu“、Mg+、Cd“、Mnn、H矿、Pb2+、Zn2+、Fe“、A13+和Fe3+金属离子溶液，再与仅一半乳糖苷酶溶液混合，使各金属离子溶液终浓度分别达到1．25mmol·L～、2．5mmol·L～、5mmol·L‘1和10mmol·L～，于4℃下孵育2h，然后测定酶活性，以去离子水与Ot一半乳糖苷酶溶液混合测得的酶活计为100％，计算各种金属离子溶液中仅一半乳糖苷酶的相对酶活。
1．5．4不同保护剂对d一半乳糖苷酶的影响
以一定比例将不同类型的保护剂与仅一半乳糖苷酶溶液混合，60℃水浴1h，取出后立即冰浴，稀释一定倍数测定酶活力，以未保温(4℃)、未加保护剂测得的酶活值计为100％，计算不同保护剂下的酶活存留率。
2结果与分析
2．1pH对云芝仅一半乳糖苷酶活性的影响
pH对云芝Ot一半乳糖苷酶活性的影响结果，见图l。
从图1A中可以看出，当缓冲液pH为3．0时0【一半乳糖苷酶活性最高，以此计为100％；pH为2．0时仅一半乳糖苷酶相对酶活性为60％，此时并未失活；随着缓冲液pH的不断升高，仅一半乳糖苷酶活性持续降低，当缓冲液pH为7．0时，相对酶活降低为10％，pH8．0时几乎检测不到酶活。
从图1B中可以看出，Ot一半乳糖苷酶溶液在缓冲液pH2．0～5．0范围内酶活存留率依然在80％171I-，说明d一半乳糖苷酶极耐酸性。因此，云芝发酵液中OL一半乳糖苷酶的最适pH为3．0，在酸性条件下酶活稳定性最好。
2．2温度对云芝d一半乳糖苷酶活性的影响
反应温度对云芝仪一半乳糖苷酶活性的影响结果见图2。
从图2C可以看出，随着反应温度的逐渐升高，OL一半乳糖苷酶活性持续增加，在60℃时酶活达到最大值，以此计为100％；随着反应温度升至70℃时，Ot一半乳糖苷酶相对酶活降低为60％，当温度为80℃时蛋白质发生了变性，此时几乎检测不到酶活。
从图2D中可以看出，当温度低于50℃时仪一半乳糖苷酶活性比较稳定，相对酶活在70％以上；随着温度的升高酶活性有降低的趋势，在60℃时酶活性迅速降至5％，反应温度为70℃时o【一半乳糖苷酶已失去活性。因此，云芝发酵液中Ot一半乳糖苷酶的最适反应温度为60cC，而且在较大温度范围内酶活性依然保持稳定，说明该酶耐热性较好。
2．3金属离子对云芝仅一半乳糖苷酶活性的影响
不同浓度的不同种类金属离子对云芝仅一半乳糖苷酶活性的影响结果见表1，以未加金属离子测得的酶活计为100％。
从表1中可以看出，Fe3+对酶活性的抑制作用最强，当离子浓度为10mmol·L。1时几乎检测不到酶活，Fe3+浓度降低至1．25mmol·L。1时酶活性才恢复到68％；Pb2+对酶活性的抑制作用也较强，当其浓度为10mmol·L。时酶活性降低至13％，随着Pb2+浓度的逐渐减小，对酶活的抑制作用也随之降低；Cd“、Cu“、ng+对d一半乳糖苷酶活性也有一定的抑制作用，酶活性降低20％。50％，Ca2+、M乎+、Znz+和Fe2+等离子对仪一半乳糖苷酶活性影响不明显。
2．4不同保护剂对云芝Ot一半乳糖苷酶热稳定性影响
不同保护剂对云芝Ot一半乳糖苷酶活性的影响结果见表2。
从表2中可以看出，除添加山梨酸钾不利于Ot一半乳糖苷酶的热稳定性以外，其它保护剂均对Ot一半乳糖苷酶热稳定性有较好的保护效果，酶活保留率均高于对照组(54．18％)；其中保护效果最好的是甘露醇，其次是海藻糖、蜜二糖、棉籽糖、L一半胱氨酸、甘油和黄原胶等。
从表2中还可以看出，同一种保护剂不同浓度对仪一半乳糖苷酶热稳定性的保护作用也不同，添加浓度2mmol·L。1的甘露醇、海藻糖、乳糖、抗坏血酸、棉籽糖、蜜二糖、L一半胱氨酸、CaCl：·2H：O、白蛋白、NaCl和明胶，酶活保留率高于添加浓度lmmol·L-1；添加浓度1mmol·L。1巯基乙醇效果好于添加浓度2mmol·L～，添加10％甘油酶活保留率高于20％，其次是0．2％黄原胶、0．3％黄原胶。
3讨论
通过对云芝发酵液中仅一半乳糖苷酶酶学性质的研究发现，Or．一半乳糖苷酶最适反应pH为3．0，并且极耐酸性，在pH2．0～5．0之间酶活性依然保持在80％以上；最适反应温度为60℃，在低于60℃条件下该酶稳定性良好，但是随着温度上升至60℃，酶活性骤然降低，说明随着温度的升高，蛋白质已经开始变性丧失活性，但是在很大温度范围内(20℃一70℃)酶活性依然保持稳定，说明该酶是1种耐热的仅一半乳糖苷酶。
金属离子对云芝d一半乳糖苷酶的影响结果显示，Pbz+和Fe3+对其酶活性有较强的抑制作用，随着金属离子浓度的升高，抑制作用越来越明显，Cd“、Cu“、ng+致使Ot一半乳糖苷酶活性降低20％～50％，其他金属离子对该酶活性的抑制作用不明显。
酶成品中常需要加入糖类、甘油、多元醇、氨基酸及其衍生物等共溶剂，以改变酶溶液的热力学性质，提高酶的稳定性，保存酶活[51。本文研究发现在云芝d一半乳糖苷酶溶液中加入几种不同的共溶剂，对仅一半乳糖苷酶热稳定性都有较好的保护效果，其中效果最好的是甘露醇，其次是海藻糖、蜜二糖、棉籽糖、L一半胱氨酸、甘油和黄原胶等；不同浓度保护剂对Q一半乳糖苷酶热稳定性的保护作用不同，添加浓度2mmol·L‘1的甘露醇、海藻糖、乳糖、抗坏血酸、棉籽糖、蜜二糖、L一半胱氨酸、CaCl：·2H：O、白蛋白、NaCl和明胶，酶活保留率高于添加浓度1mmol·L一；添加浓度1mmol·L一巯基乙醇效果好于添加浓度2mmol·L～，10％甘油酶活保留率高于20％，其次是o．2％黄原胶、0．3％黄原胶。保护云芝OL一半乳糖苷酶稳定性的共溶剂的筛选，可为提高该酶生产和储存中酶活稳定性提供一定的应用价值。
参考文献：
【l】杨志强，师昆景，于锋．饲用d一半乳糖苷酶酶活稳定性的
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