用溶剂热法制备得到Fe３O４/氧化石墨烯复合纳米粒子,并对其生物相容性进行研究。使用X射线粉末衍射仪(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)等分析仪器对其进行表征,并通过一系列溶血试验及MTT细胞毒性试验对复合纳米粒子的体外毒性进行评价。结果显示,当复合纳米粒子浓度小于５g/L时,溶血率低于５．００％;当复合纳米粒子浓度不高于０．２５g/L、孵育时间不长于７２h时,细胞相对增殖率大于７５％,属０~１级,认为此范围浓度材料没有细胞毒性。从目前的实验结果来看制备所得Fe３O４/氧化石墨烯复合纳米粒子具有良好的生物相容性,在生物医学方面具有潜在的应用前景。
四氧化三铁磁性纳米材料不仅具有普通纳米材料的介观效应,并且因为其磁性体同磁性特征物理长度(单磁畴临界尺寸、超磁性临界尺寸、电子平均自由程以及交换作用长度等)处于纳米量级,使得其与普通磁性材料相比具有更为独特的磁学性质[１]。目前四氧化三铁磁性纳米材料在磁分离(包括细胞、蛋白质检测、核酸、酶、病毒等)、靶向给药、疾病诊断和治疗(如核磁共振和磁流体热疗)等生物医学方面应用广泛[２-５]。但是,由于磁性纳米粒子粒径小,比表面积大,而且存在粒子间相互磁作用,因此聚集倾向较强,易于团聚,使其应用受到限制[６]。表面修饰能够降低磁性纳米粒子的表面能,提高其水溶性与分散性,并且能够赋予粒子特殊的功能(如反应特性、生物相容性与抗氧化稳定性等)[７-８]。
氧化石墨烯(grapheneoxide,GO)是石墨烯重要的衍生物[９],核磁共振、X射线光电子谱及红外光谱的分析测试表明,在氧化石墨烯中含有大量的羧基、羟基、羰基和环氧基等诸多含氧官能团,因此拥有诸多新特性,如分散性、亲水性、与聚合物的兼容性、与含氧无机物的牢固生长结合等,被认为是一种理想的四氧化三铁修饰材料[１０-１１]。经过氧化石墨烯表面修饰的四氧化三铁磁性纳米材料的制备与应用研究也日益增多,尤其是在生物医学方面[１２-１３]。Wang等[１４-１５]采用共沉淀法制备获得Fe３O４/GO磁性纳米粒子,并进行了一系列的磁共振与靶向载药应用研究;Heidarizadeh等[１６]将制备获得的Fe３O４/GO磁性纳米粒子进行了脂肪酶的固定研究,这些研究表明Fe３O４/GO磁性纳米粒子能够很好地应用于生物医学领域。但是能否将其安全地应用于人体,尚须对其生物相容性进行检测,这也是医用生物材料能否走向临床医疗的关键。
本文采用绿色无毒的试剂,通过溶剂热法制备获得四氧化三铁/氧化石墨烯(Fe３O４/GO)复合纳米粒子,并对其制备过程的工艺条件进行优化探究。通过体外细胞毒性检测与溶血试验对制备的磁性纳米粒子的体外细胞毒性与血液相容性进行研究,以期为其今后在临床应用中提供可靠的理论依据。
１实验
１．１实验试剂
天然石墨、硝酸钾、高锰酸钾、双氧水、六水合氯化铁、乙二醇、聚乙二醇２０００、无水乙酸钠、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇均为分析纯(购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)。DMEM培养基、FBS胎牛血清、磷酸盐缓冲液PBS、青霉素、链霉素、３-(４,５-二甲基噻唑-２)-２,５-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(广东东锐有限公司)。新鲜人体血液由海口市人民医院提供。L-９２９小鼠成纤维细胞购自中国科学院上海细胞库。
１．２实验方法
氧化石墨的制备:通过改进的Hummers方法制备获得氧化石墨[１７]。将５．０g天然石墨粉和５．０g硝酸钾加入到２００mL浓硫酸中,在冰浴０~２℃下缓慢加入２０．０g高锰酸钾并持续搅拌２h,接着在室温下继续搅拌２h,缓慢加入４００mL去离子水,迅速升温至９８℃继续搅拌１h,结束之后加入４００mL水稀释,再加入３０mL质量分数３０％的H２O２溶液终止反应,过滤。滤饼用质量分数５％的盐酸清洗,离心,再用水洗至中性,离心。最后将得到的产物冷冻干燥,备用。
Fe３O４/GO复合纳米粒子的制备:取一定量的氧化石墨分散于５０mL乙二醇中超声１２h获得氧化石墨烯分散液,将０．５g的六水合氯化铁加入到分散液中搅拌１h,接着加入３．６g乙酸钠和３．６g聚乙二醇２０００继续搅拌１h。将上述混合物移入高压釜中,在２００℃下反应一定时间,所得产物用去离子水与乙醇交替清洗离心数次,置于真空干燥箱６０℃干燥,备用。
体外毒性试验:(１)溶血实验:抽取新鲜人体血液２mL,注入枸橼酸钠抗凝管;将抗凝全血与生理盐水以体积比４∶５稀释;用生理盐水将制备的Fe３O４/GO复合纳米粒子以及Fe３O４纳米粒子配制成不同浓度溶液(浓度分别为０．１、１．０、５．０、１０．０g/L),全部样品试管３７℃水浴７２h;以蒸馏水为阳性对照,生理盐水为阴性对照;１mL溶液加入２５μL稀释抗凝全血,３７℃下气浴震荡１５０min,１００００r/min离心５min,取上清液于５４０nm波长处测定吸光度(OD值),每组平行３个样,重复实验。
(２)细胞毒性实验(MTT法):用含体积分数１０％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔５×１０３个细胞接种到９６孔板,每孔体积１００μL。培养２４h后,吸弃５０μL原液,加入５０μL不同浓度的
Fe３O４/GO复合纳米粒子及Fe３O４纳米粒子,使终浓度分别为１５．６、６２．５、２５０．０、１０００．０mg/L。阴性组为培养液,阳性组为DMSO。３７℃、体积分数５％的CO２空气培养箱内各培养２４、３６、４８、６０、７２h,每孔加２０μLPBS配制的５g/LMTT溶液。继续孵育４h,终止培养,翻板弃除孔内培养上清液。每孔加１５０μLDMSO,振荡１０min,使结晶物充分溶解。选择４９０nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(OD值),每个浓度设６复孔,重复实验,记录结果。
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