不同固定剂对核膜蛋白免疫荧光效果的比较研究

时间:2018-03-07 编辑整理:吴卓玲 赖艳花 杨柳 来源:早发表网

免疫荧光技术是检测蛋白质细胞定位的常用方法,不同的细胞固定方法可能会影响染色效果。本文以核膜蛋白laminA/C、emerin为研究对象,利用3种不同固定剂进行免疫荧光实验。结果表明,利用体积分数为4%多聚甲醛溶液固定细胞通常可以获得良好的免疫荧光染色效果,利用甲醇固定时laminA/C染色效果相对较弱,而利用丙酮固定的细胞其荧光信号往往呈现为核膜不连续染色。综合分析,作为最常用的固定剂,利用4%多聚甲醛溶液通常可以取得较好的染色效果;但对于新的目的蛋白来说,由于蛋白质的结构与功能特异性,适合的固定方法仍需要具体的试验检测才能确定。

 

免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针,检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)。经过反应,形成的抗原抗体复合物带有荧光素,在荧光显微镜下可分辨出抗原或抗体所在位置及性质[1]。影响免疫荧光效果的因素有很多,不同的细胞固定方式可直接影响实验结果,甚至会得出错误的实验结论[2]。使用的固定剂主要有交联剂和有机溶剂两类。交联剂主要有多聚甲醛、甲醛,有机溶剂主要有甲醇、丙酮等,但是同一种蛋白使用不同的固定剂得出的结果可能不一样,目前尚无一种标准固定剂可用于各种抗原的固定[3-4]。研究发现,不同的固定剂对核膜蛋白有不同的影响。本文探讨3种不同的固定方法对细胞核膜蛋白的影响,为选出最适合某一蛋白的固定方法提供依据。本文中使用的子宫颈癌细胞Hela细胞具有无限增殖能力,是生物学与医学研究、肿瘤研究中常用的一种细胞。

 

1材料与方法

1.1细胞培养用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养Hela细胞,当细胞融合度达90%时,用0.25%胰蛋白酶溶液消化成单细胞悬液并接种于预先放有专用盖玻片的24孔板内,接种2组,每组3张爬片,细胞放于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱培养过夜。

1.2固定方式样本采用3种不同的固定方式:方式Ⅰ———4%多聚甲醛溶液(PFA)室温固定15min后,用体积分数为0.1%Trition-X100溶液(用PBS稀释)通透15min;方式Ⅱ———预冷的甲醇-20℃固定10min;方式Ⅲ———预冷的丙酮-20℃固定10min。

1.3抗体来源核膜蛋白laminA/C一抗为鼠单克隆抗体,核膜蛋白emerin一抗为鼠单克隆抗体,二抗为山羊抗鼠,均购自于SantaCruz公司。

1.4免疫荧光反应Hela细胞分为2组,每组准备3张爬片。移去培养基,用PBS清洗,加入固定液。3张爬片分别采用1.2节的3种方式固定。固定结束后用PBS冲洗,将固定好的样本用20g/LBSA封闭1h,往2组中分别加入不同的一抗:一组为laminA/C;另一组为emerin。一抗浓度体积比均为1∶100,4℃孵育过夜。一抗孵育后用PBS冲洗,加入山羊抗鼠二抗室温避光孵育1h,用PBS冲洗后加入DAPI染色10min,PBS冲洗后用封片剂封片。

1.5评价方法使用KarlZeissLSM710激光共聚焦扫描显微镜(KarlZeiss)观察,扫描获取图像。扫描参数:DAPI激发波长为405nm,山羊抗鼠(即与laminA/C或emerin相结合的二抗)激发波长为543nm,DAPI扫描针孔(Pinhole)为110μm,山羊抗鼠扫描针孔(Pinhole)为99μm。同一种蛋白的扫描参数固定不变。所观察到的图像主要以细胞形态学特征和荧光强度作为判断的指标。

 

2结果

  1. Hela细胞核膜蛋白laminA/C的免疫荧光染色对比4%PFA溶液、甲醇固定的Hela细胞染色后,核区DAPI信号清晰、对比度好,但是4%PFA溶液固定的DAPI信号强度比甲醇固定的稍弱;丙酮固定的细胞核形态略有变形,核区DAPI着色较深且有弥散至胞浆内的现象。4%PFA和甲醇固定的laminA/C荧光信号清晰、着色均匀,但甲醇固定的laminA/C荧光信号相对较弱;丙酮固定的laminA/C荧光信号不均匀。详见图1,其中merge图片是DAPI荧光信号和laminA/C荧光信号合并在一起。

     

    2.2Hela细胞核膜蛋白emerin的免疫荧光染色对比4%PFA、甲醇固定的emerin荧光信号明亮、着色均匀,细胞背景清晰,但甲醇固定的emerin染色效果相对较弱;丙酮固定的emerin荧光信号虽然局部效果不错,但有的emerin在核膜上却呈现出不连续分布。详见图2,其中merge图片是DAPI荧光信号和emerin荧光信号合并在一起。

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