【摘要】检测寻常痤疮患者囊肿皮损中白介素6(IL．6)的表达，并观察痤疮丙酸杆菌体外对人急性单核细胞白血病细胞系THP．1信号分子p38MAPK及白介素6水平的影响。方法实时荧光定量PCR检测6例痤疮患者囊肿皮损和6例健康人皮肤组织中IL一6mRNA表达水平。用2×1062×107、2×108CFU／ml灭活痤疮丙酸杆菌菌悬液或脂多糖(100pg／i)刺激THP．1细胞，同时设培养基对照组和p38MAPK抑制剂SB203580组(先用20I山mol／LSB203580处理，再用2×108CFU／ml痤疮丙酸杆菌刺激)，作用不同时间(1—6h)后，实时荧光定量PCR检测IL．6mRNA表达水平，酶联免疫吸附试验检测上清液中IL．6含量。2×108CFU／ml灭活痤疮丙酸杆菌菌悬液刺激THP．1细胞15、30、60min或脂多糖(100斗g／L)刺激30min后，Western印迹法检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK表达水平。结果痤疮囊肿皮损和健康对照皮肤IL．6mRNA水平分别为3．680±O．790、1．155±0．250，两组比较差异有统计学意义(t=3．047，P<0．05)。双因素方差分析显示，不同浓度痤疮丙酸杆菌组、脂多糖组、培养基对照组IL．6mRNA表达水平差异有统计学意义(F=532．3，P<0．001，v=4)，痤疮丙酸杆菌刺激l、3、6h之间差异也有统计学意义(F=526．6，P<0．001，v=2)。2×108CFU／ml痤疮丙酸杆菌组、脂多糖组、培养基对照组上清液中IL．6浓度分别为(1618．22±32．23)、(3212．06±353．00)、(147．10±0．53)nCL，3组间差异有统计学意义(v=2，F=102．35，P<0．01)。2×108CFU／ml痤疮丙酸杆菌作用于THP．1细胞15、30、60min后磷酸化p38MAPK蛋白水平升高。SB203580组THP．1细胞IL．6mRNA水平与未抑制组比较明显降低(t=15．91，P=0．004)。结论寻常痤疮患者囊肿中IL一6mRNA水平显著升高。痤疮丙酸杆菌体外可激活人THP．1细胞信号分子p38MAPK，促进其分泌IL．6。
【关键词】寻常痤疮,痤疮丙酸杆菌,白细胞介素6,白血病,单核细胞,急性,p38丝裂原活化蛋白激酶类
痤疮是一种常见的毛囊皮脂腺慢性炎症性皮肤病，其临床严重程度与炎症反应程度密切相关。研究发现，痤疮患者皮损及非皮损处毛囊周围存在大量CD4+T细胞和巨噬细胞。痤疮丙酸杆菌的过度繁殖以及其诱导的炎症反应在痤疮发病机制中起重要作用L2。。我们初步检测白介素6(IL．6)在寻常痤疮患者囊肿皮损中的表达，并在体外研究痤疮丙酸杆菌能否激活人急性单核细胞白血病细胞系细胞(THP．1)信号分子p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，诱导IL一6产生。
材料与方法
1．临床标本：在中国医学科学院皮肤病医院收集6例寻常痤疮患者手术切除的痤疮囊肿皮损组织，同时收集6例健康人组织标本作为对照组，两组中男女各3例，年龄18．30岁，标本均取白头面部。本研究通过中国医学科学院皮肤病医院医学伦理委员会批准(批件号：2016．KY．012)，受试者均签署知情同意书。
2．菌株、细胞、主要试剂：痤疮丙酸杆菌来自广东微生物研究所，100℃10min水浴灭活后，配制成不同浓度菌悬液待用。人THP．1细胞株来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。兔抗人p38MAPK和磷酸化p38MAPK抗体为美国CellSignalingTechnology公司产品。实时荧光定量试剂盒iTaqUniversalSYBRGreenSupermix为美国Bio—rad公司产品。PrimeScriptRTMasterMix反转录酶试剂盒为日本TaKaRa公司产品。IL一6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒为上海欣博盛公司产品。佛波酯(PMA)、脂多糖、p38MAPK抑制剂(SB203580)为美国Sigma公司产品。
3．细胞培养：于37oC、5％CO：条件下在含10％胎牛血清、1％青链霉素的RPMI1640培养基中培养、传代人THP．1细胞。制备105个／m1的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板(每孔2ml，用于Western印迹分析)或12孔细胞培养板(每孔1ml，用于实时荧光定量反转录PCR及ELISA分析)，加入100mg／L佛波酯刺激48h后，加入不同浓度痤疮丙酸杆菌共培养。
4．实时荧光定量反转录PCR检测IL一6mRNA表达水平：终浓度为2×106、2×107、2X108菌落形成单位(CFU)／ml的痤疮丙酸杆菌菌悬液与2×105／mlTHP一1共孵育，同时设培养基对照组、脂多糖(100州L)组，作用1、3、6h后收集各组细胞。另外，将表1痤疮丙酸杆菌X寸THP—l细胞系白介素6mRNA水平的影响(2‘△“‘，面±s)267注：n=3。与培养基对照组比较，8P<0．05，。P<0．01，。P<0．001。CFU菌落形成单位部分THP．1细胞分为3组，即2X108CFU／ml痤疮丙酸杆菌组、SB203580组(20Ixmol／LSB203580预先与细胞共培养30min，再接受2×108CFU／ml痤疮丙酸杆菌菌悬液刺激)、培养基对照组，刺激6h后收集各组细胞。
TRIzol法抽提组织标本和作用一定时间后各组THP．1细胞总RNA，按PrimeScriptRTMasterMix反转录酶试剂盒说明书将1斗g总RNA反转录为cDNA。使用ABI7300PCR仪，采用Sybergreen法对目的基因进行扩增。IL一6基因正向引物序列为5’一CGAGTGACAAGCCTGTAGC一3’，反向引物为57一GGTGTGGGTGAGGAGCACAT一37；B肌动蛋白正向弓l物序歹0为5’一TCTGGCACCACAcCTTCTA．3’，反向弓l物为57．AGGCATACAGGGACAGCAC一3’。采用2以战‘法计算目的基因变化水平，ACt=Ct月的基因一CtB肌动蛋白，AACt=ACt样品一ACt对照组。实验重复3次。
5．ELISA检测细胞培养上清液中IL一6分泌量：2×108CFU／ml痤疮丙酸杆菌与2×105／mlTHP．1细胞共孵育24h，同时设置培养基对照组和脂多糖(100ixg／L)组，按照试剂盒说明书检测上清液中IL一6含量。
6．Western印迹检测细胞中p38MAPK和磷酸化p38MAPK蛋白水平：用2×108CFU／ml灭活痤疮丙酸杆菌菌悬液作用于THP．1细胞15、30、60min后或脂多糖(100p。g／L),1]激30min后，裂解细胞，提取总蛋白，同时设置培养基对照组。每组样品均取50斗g总蛋白用12％十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至聚偏二氟乙烯膜上。5％牛血清白蛋白封闭2h，兔抗人单克隆抗体4℃孵育过夜。用含吐温20的Tris缓冲液(TBST)洗膜3次后，加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgGZ．抗反应2h，TBST液洗膜3次，Supersignal试剂显色发光，检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平。实验重复3次。
7．统计学处理：不同时间、不同组间IL一6mRNA表达水平的比较采用双因素方差分析，不同组间IL一6蛋白含量的比较采用单因素方差分析，并采用LSD—t检验进行两两比较，P<0．05为差异有统计学意义。
结果
1．寻常痤疮囊肿皮损中IL．6mRNA水平：痤疮囊肿皮损和健康对照皮肤IL一6mRNA水平(2-6ac,)分别为3．680±0．790、1．155±0．250，两组差异有统计学意义(t=3．047，P<0．05)。
2．痤疮丙酸杆菌对THP一1细胞IL．6mRNA水平的影响：双因素方差分析显示，不同浓度痤疮丙酸杆菌组、脂多糖组、培养基对照组IL一6mRNA表达水平差异有统计学意义(v=4，F=532．3，P<0．001)，痤疮丙酸杆菌刺激1、3、6h之间差异也有统计学意义(v=2，F=526．6，P<0．001)，各组IL一6mRNA水平随痤疮丙酸杆菌刺激时间延长增高，且呈剂量依赖效应。见表1。因此，后续试验选择2X108CFU／ml痤疮丙酸杆菌作用6h。
3．痤疮丙酸杆菌对THP一1细胞IL．6蛋白分泌的影响：痤疮丙酸杆菌组、脂多糖组、培养基对照组上清液中IL一6浓度分别为(1618．22±32．23)、(3212．06±353．00)、(147．10±0．53)ng／L，单因素方差分析显示3组间差异有统计学意义(v=2，F=102．35，P<0．01)，痤疮丙酸杆菌组与对照组相比，IL．6分泌水平明显升高，差异有统计学意义(P<0．001)。
4．痤疮丙酸杆菌对THP．1细胞p38MAPK激活的影响：2×108CFU／ml痤疮丙酸杆菌刺激15min后磷酸化p38MAPK蛋白水平已有升高，30rain时显著升高，60min时下降；阳性对照脂多糖刺激30min后亦显著升高。见图1。
5．SB203580对痤疮丙酸杆菌上调THP一1细胞IL．6mRNA水平的影响：痤疮丙酸杆菌组、SB203580组、培养基对照组IL．6mRNA表达水平分别为128．50±5．13、36．70±2．70、1．00±0．53，3组差异有统计学意义(Ⅳ=2，F=459．32，P<0．001)，SB203580组显著低于痤疮丙酸杆菌组(f=15．91，P=0．004)。
讨论
Trivedi等b1采用芯片法检测痤疮患者炎性丘疹皮损的RNA表达谱，并采用定量PCR验证，发现多种与炎症相关分子的mRNA表达增高，包括基质金属蛋白酶1、3(MMP．1、3)和IL．8、B防御素4等。有学者发现在痤疮皮损中炎症相关因子高表达，包括肿瘤坏死因子d、B防御素1、IL一37和MMP．1、2等。我们选择炎症反应强的痤疮皮损一囊肿进行检测，发现皮损中促炎症因子IL一6mRNA水平比对照组增高2．2倍。IL．6在炎症早期阶段能诱导产生急性时相反应蛋白，且抗IL．6或抗IL一6受体抗体均能明显降低C反应蛋白。IL一6可通过激活信号转导与激活转录因子3(STAT一3)协同诱导初始CD4+T细胞形成Thl7效应细胞，还可抑制Treg细胞功能、阻止Thl7细胞转化成为Treg细胞哺3。Kistowska等n3曾报道IL一17A在中重度痤疮皮损中高表达，Thl7细胞参与痤疮炎症反应。
Lyte等随1报道热灭活痤疮丙酸杆菌和活菌体外均能诱导人角质形成细胞产生IL．8。我们采用热灭活痤疮丙酸杆菌体外作用人THP．1细胞，导致IL一6mRNA和蛋白水平均升高。2×108x2×107、2×106CFU／ml痤疮丙酸杆菌刺激1h后，IL一6mRNA水平分别上升3．8倍、0．4倍或无变化；刺激3h后，分别升高约38倍、7倍及0．6倍；刺激6h后，分别升高106倍、10倍及1．5倍，表明痤疮丙酸杆菌上调THP一1细胞IL．6mRNA水平既呈时间依赖方式又有剂量一效应关系。此外，2×108CFU／ml痤疮丙酸杆菌刺激后24h，痤疮丙酸杆菌组上清液IL一6蛋白含量也明显升高。
有研究表明，痤疮皮损中有Toll样受体(TLR)2、TLR4等表达b1。人单核巨噬细胞、角质形成细胞表达的TLR2可识别痤疮丙酸杆菌，诱导炎症因子产生。TLR与配体结合后，可激活下游信号分子包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，如c．Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外调节激酶(ERK)及p38MAPK等。p38MAPK被激活后可进一步激活下游丝裂原及应激激活蛋白激酶(mitogen．andstress．activatedkinases)、丝裂原激活蛋白激酶信号整合蛋白激酶(MAPKsignal—integratingkinase)，进而促进促炎症因子转录及合成阳1。本实验结果表明，痤疮丙酸杆菌刺激15min后即出现p38MAPK蛋白磷酸化，30min时达峰值，60min时有所降低。进一步采用p38MAPK特异性阻断剂SB203580预处理THP一1细胞后再用痤疮丙酸杆菌刺激，结果表明，IL．6mRNA表达水平明显减低，抑制p38MAPK活性可降低IL一6转录。
本研究初步表明，痤疮囊肿皮损中促炎症因子IL．6mRNA水平增高，痤疮丙酸杆菌体外能诱导人THP．1单核细胞产生IL一6并激活p38MAPK，且IL一6的产生依赖p38MAPK信号分子。提示痤疮丙酸杆菌通过激活p38MAPK产生IL．6来参与痤疮炎症反应。
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