【摘要】探讨microRNA．143(miR．143)对白介素13(IL．13)诱导的人角质形成细胞组织激肽释放酶7(KLK7)表达的影响。方法取对数生长期人皮肤原代角质形成细胞(NHEK)，分别用0、2、10、50i-Lg／LIL．13处理24h，或用50斗g／LIL．13分别处理0、6、12、24、48h后，收集细胞，提取细胞总RNA，实时荧光定量PCR检测KLK7基因mRNA水平。再取部分NHEK，分为4组，即NHEK组(空白对照组，既不转染也不用IL．13刺激)、IL一13组(仅用50斗g，LIL．13处理)、miR—NC组(转染microRNAmimics阴性对照后用50“f；／LIL．13处理)和miR一143组(转染miR．143mimics后用50p．g／LIL．13处理)，IL．13处理24h后，实时荧光定量PCR检测各组中KLK7mRNA的相对表达水平，Western免疫印迹检测KLK7蛋白表达水平。结果0、2、10、50p班IL一13处理NHEK24hA，KLK7mRNA的相对表达水平分别为1．00±0．12、0．89±0．04、1．15±0．09和1．70±0．10，随着IL一13浓度的升高，KLK7mRNA相对表达水平有上升趋势(F=92．48，P<0．05)。50州LIL．13分别处理NHEK0、6、12、24、48h后，KLK7mRNA相对表达水平分别为1．00±0．05、1．05±0．12、1．71±0．20、1．97±0．19和2．48±0．13，随着IL．13处理时间延长，KLK7mRNA的相对表达水平有上升趋势(F=206．44，P<0．05)。与miR—NC组KLK7的mRNA和蛋白相对表达水平相比，miR．143组均降低，差异有统计学意义(t值分别为6．76、4．23，均P<0．05)。结论在人角质形成细胞中，IL一13上调KLK7的表达可能与miR．143的调控相关。
【关键词】皮炎,特应性,角质形成细胞,白细胞介素13,组织激肽释放酶7,微RNA．143
特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病，临床特征为严重瘙痒和复发性湿疹样皮损n]。AD发病机制主要包括表皮屏障结构和功能异常以及免疫功能紊乱，在AD的发病过程中，二者存在相互作用、互为因果的联系陋1。本课题组的前期研究证实，白介素13(IL．13)可以下调角质形成细胞中表皮屏障相关蛋白如丝聚合蛋白、兜甲蛋白和内披蛋白的表达，而上调角质形成细胞中microRNA一143(miR一143)的表达则可逆转IL一13对以上3种蛋白表达的影响b1。我们拟在前期工作基础上，探讨miR．143是否可以影响IL．13诱导的组织激肽释放酶7(kallikrein7，KLK7)的表达，为miR．143在AD发病中的作用提供更多的理论依据。
材料与方法
一、细胞系、试剂和仪器
正常人皮肤原代角质形成细胞(primarynormalhumanepidermalkeratinocytes，NHEK)、无血清角质形成细胞培养基(德国PromoCell公司)，重组人IL．13蛋白(美国RD公司)，反转录试剂盒、超级ECL发光试剂盒(美国ThermoFisher公司)，TrizolRNA提取液、脂质体转染试剂Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)，SYBRGreenqPCRMix(广州东盛生物科技有限公司)，miR．143mimics、miR．NC(microRNAmimics阴性对照)(广州锐博生物科技有限公司)，Bradford蛋白浓度测定试剂盒、iQ5实时荧光定量PCR仪(美国Bio—Rad公司)，抗KLK7抗体(美国SantaCruz公司)、3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(天津三箭生物技术有限公司)，天能Tanon4200全自动化学发光成像分析系统(上海天能科技有限公司)。
二、方法
1．细胞培养和分组：NHEK常规复苏成功后，用无血清角质形成细胞培养基于37℃、5％CO：培养箱中培养，细胞传至3至5代时，取对数生长期细胞接种于12孔培养板中(1×105／孔)，接受以下分组处理。①加人终浓度分别为0、2、10、50¨g，L的IL—13，继续孵育24h后终止培养；②加入50斗g，LIL．13，分别孵育0、6、12、24、48h后终止培养。以上两部分实验每组设3个复孔，终止培养后收集细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA用于后续实验。
2．细胞转染：在转染前1d，用胰蛋白酶消化细胞后，以3×105个／孑L接种于6孔板，37c|c、5％CO：培养，使转染前细胞融合度为70％一80％。转染当天，换新鲜无抗生素完全培养基，37℃孵育，转染前拍照记录。采用Lipofectamine2000将miR．143mimics和miR．NC分别转染人NHEK，24h后用荧光显微镜观察细胞转染效率(荧光细胞比例超过80％认为达到转染要求)，拍照记录。NHEK分为4组，@NHEK组：不接受转染或IL．13刺激；②IL一13组：仅用50txg／LIL．13处理；③miR—NC组：转染microRNAmimics阴性对照24h后用50¨∥LIL．13处理；@miR．143组：转染miR．143mimics24h后用50州LIL．13处理，孵育24h，每组设3个复孑L。收集细胞，分别提取细胞总RNA和总蛋白，用于后续实验。
3．实时荧光定量PCR检测KLK7基因mRNA水平：采用反转录试剂盒，按照标准实验流程将上述实验中提取的总RNA反转录为cDNA，按SYBRGreenqPCRMix试剂盒按说明书扩增目的基因。反应体系如下：cDNA模板5斗l，正反向引物各0．5斗l，2×SYBRGreenqPCRMix10Ixl，去离子水4斗l，最终反应体积20斗l。引物序列：KLK7正向引物57．GTGACTCAGGGGGACCGTT一37，反向引物5’一TCAGTGTGGCGlTrAGCGAT．37；B肌动蛋白正向引物57一GCACCCAGCACAATGAAGA．37，反向引物5’．AATAAAGCCATGCCAATCTCA．3’。PCR反应条件：95cC预变性2min；95℃变性15S，60oC退火20S，72℃延伸20S，共40个循环。以B肌动蛋白为内参照，记录各实验孑LCt值，以2-aac,表示目的基因的相对表达水平。
4．免疫印迹实验检测KLK7蛋白水平：采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定上述实验中提取蛋白样本浓度。制备聚丙烯酰胺凝胶，上样，电泳，转膜。采用封闭液室温封闭PVDF膜1h，用新鲜配制的封闭液稀释一抗(抗体稀释比例KLK71：200，GAPDH1：3000)，4oC过夜9呼育。洗膜后加入二抗(稀释比均为1：3000)，室温孵育PVDF膜1h。以GAPDH为内参蛋白。洗膜后采用超级ECL发光试剂盒化学发光，在化学发光成像分析系统中显影。实验重复3次。使用ImageJ1．51k软件测量目的蛋白条带的灰度值，并与GAPDH蛋白条带的灰度值对比，计算目的蛋白相对表达水平。
5．统计学方法：采用SAS9．4统计软件分析。计量资料服从正态分布者采用孑±S进行统计学描述。KLK7mRNA的相对表达水平与IL．13处理浓度和处理时间的趋势性采用线性趋势检验。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较首先采用单因素方差分析，再采用LSD—t检验进行两两间多重比较。P<0．05为差异有统计学意义。
结果
一、不同浓度IL—13对NHEK中KLK7基因mRNA水平的影响
0、2、10、50I山g／LIL．13组KLK7mRNA的相对表达水平分别为1．00±0．12、0．89±0．04、1．15±0．09、1．70±0．10，线性趋势检验发现，IL—13浓度与KLK7mRNA相对表达水平之间有线性关系(F=92．48，P<0．05)，随着IL．13浓度升高，KLK7mRNA相对表达水平有上升趋势。
二、IL．13处理NHEK不同时间对KLK7基因mRNA水平的影响
50txg／LIL一13处理0、6、12、24和48h后KLK7mRNA相对表达水平分别为1．00±0．05、1．05±0．12、1．71±0．20、1．97±0．19、2．48±0．13。线性趋势检验发现，IL．13处理时间与KLK7mRNA的相对表达水平之间有线性关系(F=206．44，P<O．05)，随着50Ixg／LIL一13处理时间延长，KLK7mRNA的相对表达水平有上升趋势。
三、miR．143对NHEK中IL．13诱导的KLK7mRNA和蛋白表达水平的影响
1．转染效率：转染NHEK24h后，与明视场显微镜下对比，荧光显微镜观察同一视野下荧光细胞比例大于90％，故认为转染成功。
2．KLK7mRNA表达水平比较：见表l。与NHEK组相比，IL．13组KLK7mRNA相对表达水平升高(t=7．12，P<0．05)。单因素方差分析显示，IL．13组、miR．NC组和miR．143组间KLK7mRNA相对表达水平差异有统计学意义(F=26．89，P<0．05)，而il一13组和mir．nc组间差异无统计学意义(t=0．91，p>0．05)，miR一143组低于IL．13组和miR．NC组，差异均有统计学意义(仁5．85、6．76，均P<0．05)。
3．KLK7蛋白表达水平比较：见表1、图1。与NHEK组相比，IL．13组KLK7蛋白相对表达水平升高(t=4．85，P<0．05)。单因素方差分析显示，IL—13组、miR—NC组和miR一143组间KLK7蛋白相对表达水平差异有统计学意义(F=13．26，P<0．05)，而il一13组和mir—nc组间差异无统计学意义(t=o．42，p>0．05)，miR一143组低于IL．13组和miR．NC组，差异均有统计学意义(t=4．65、4．23，均P<0．05)。
讨论
目前认为，Th2型免疫反应在AD免疫功能紊乱中发挥主导作用，其中Th2型细胞因子如IL．4和IL．13起关键作用。2。针对IL．4和IL．13共同受体IL一4Ra的生物制剂Dupilumab，目前已在美国上市，成为首个获批治疗AD的生物制剂。4，这也显示IL一4和IL—13在AD发病中的核心作用。
KLK在皮肤中最主要的生理功能为促进皮肤脱屑，通过降解桥粒芯糖蛋白1、桥粒芯胶蛋白1和角质层锁链蛋白来促进浅层角质形成细胞脱落，从而维持皮肤稳态，5。KLK7是第一个从角质层中以活化形式鉴定出来的KLK，也是表皮中唯一的糜蛋白酶。既往研究表明，KLK7转基因小鼠模型可呈现AD的临床特征。与健康对照组比较，AD患者表皮KLK7蛋白表达水平升高，蛋白酶活性增强。最新研究发现，若婴儿出生时表皮KLK7酶活性升高，可能与其日后发生皮肤屏障功能损伤和AD相关。以上研究提示，降低KLK7的表达或阻断其过度活化的酶活性可作为AD的治疗策略之一。
体外实验表明，IL一4和IL．13可以诱导NHEK或HaCaT细胞中KLK7mRNA和蛋白水平升高，酶活性增强’8·12。13；。提示在AD中，KLK7的表达和活性除了受蛋白酶抑制剂和各种理化因素影响外，还可能与机体的免疫功能紊乱，特别是Th2型免疫反应相关。但是，Th2型细胞因子调控KLK7表达的具体机制目前尚无报道。本研究结果显示，随着IL—13处理时间的延长和浓度升高，KLK7mRNA表达均呈上升趋势，提示在体外实验中，KLK7表达与IL一13浓度和作用时间密切相关。
本研究结果显示，在NHEK中过表达miR一143可逆转IL．13对KLK7上调表达的效应。由于IL一13Ra1是IL．13的重要受体之一，结合本课题组前期工作可以推测，miR．143针对KLK7表达的上述效应，也可能是通过直接负向调控IL一13Rcd来实现的。
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