摘要：采用溶胶-凝胶法，以丙烯酰胺作为单体，制备了基于有机-硅胶杂化整体柱的β-葡萄糖醛酸酶反应器。优化了硅酸甲酯和γ（甲基丙烯酰氧-）丙基三甲氧基硅的物质的量的比、丙烯酰胺和聚乙二醇的用量，以及水浴温度等制备条件，获得了孔隙均匀、通透性良好、机械强度高的有机-硅胶杂化整体柱。采用光学显微镜和扫描电镜表征杂化整体柱。进一步将β-葡萄糖醛酸酶共价键合在整体柱上，以4-甲基亚硝胺基-1（-3-吡啶）-1-丁醇（ＮＮＡＬ）的Ｏ-糖苷化合物（ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ）为底物研究酶反应器的水解效果，实验结果证明酶反应器在室温条件下的水解效率大大提高，实现了ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ高效水解与分析，解决了目前ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ分析中前处理水解效率低的问题。
关键词：有机-硅胶杂化整体柱,β-葡萄糖醛酸酶,固定化酶反应器,4-甲基亚硝胺基-1（-3-吡啶）-1-丁醇的Ｏ-糖苷化合物
4-甲基亚硝胺-1（-3-吡啶）-1-丁酮（ＮＮＫ）是烟草制品中一类非常重要的化合物。它是尼古丁亚硝基化或微量烟碱亚硝基化形成的一种烟气致癌物［1-4］，主要通过生物降解和动物体内的ＤＮＡ及血红蛋白发生键合，产生致癌性［5］。在细胞色素Ｐ450酶和谷胱甘肽转硫酶调控下的体内代谢产物4-甲基亚硝胺基-1（-3-吡啶）-1-丁醇（ＮＮＡＬ）及其糖苷化衍生物（ＮＮＡＬ-Ｇｌｕｃｓ）是研究ＮＮＫ在人体内代谢过程中致毒与解毒机制的非常有价值的接触生物标志物［6］。游离态ＮＮＡＬ及ＮＮＡＬ-Ｇｌｕｃｓ的含量总和与游离态ＮＮＡＬ含量的比值可用于评估与ＮＮＫ有关的癌症发生的风险［7］。对人体体液内ＮＮＫ代谢物的研究主要包括对游离ＮＮＡＬ、ＮＮＡＬ的Ｏ-糖苷化合物（ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ）及Ｎ-糖苷化合物（ＮＮＡＬ-Ｎ-Ｇｌｕｃ）的分析与研究［7-10］。
目前，ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ的前处理方法主要是通过水解法去糖基化，从而得到游离的ＮＮＡＬ。该过程可以通过酶水解方式进行，其中通过β-葡萄糖醛酸酶水解的方式应用较多。但传统的酶水解反应具有耗时较长（16-24ｈ）、水解效率较低等缺点［11］，严重制约烟气体内代谢物的高通量分析。针对上述缺点，固定化酶反应器应运而生［12-16］。在蛋白质组学领域，袁辉明等［13］通过制备有机-硅胶杂化整体柱基质的胰蛋白酶反应器，将蛋白质水解时间从常规的16ｈ缩短到2.5ｍｉｎ，为实现大分子的高通量分离分析提供了必要条件。宋佳一等［16］通过ＤＮＡ链置换反应制备了重复性好、酶切效率高的固定化胰蛋白酶反应器。但是，到目前为止，尚未有β-葡萄糖醛酸酶固定化酶反应器的报道。在本研究中，我们制备了基于有机-硅胶杂化整体柱基质的β-葡萄糖醛酸酶反应器，并结合ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ检测手段用于ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ的水解与分析。旨在发展一种新型的有机-硅胶杂化整体柱基质，建立ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ快速酶解方法，为进一步研究ＮＮＫ的体内代谢机制提供技术方案。
1实验部分
1．1仪器、试剂与材料
Ａｇｉｌｅｎｔ1290超高效液相色谱仪和Ａｇｉｌｅｎｔ6490三重四极杆质谱仪（美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；超纯水仪（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；扫描电镜（日本日立公司）；光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；真空冻干机（美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司）；低温高速离心机（美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司）。
尿素、聚乙二醇（ＰＥＧ）、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（γ-ＭＡＰＳ）、偶氮二异丁腈（ＡＩＢＮ）、β-葡萄糖醛酸酶均购自美国Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ公司；硅酸甲酯（ＴＭＯＳ）、丙烯酰胺（ＡＡＭ）、氰基硼氢化钠、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙腈、甲醇、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、戊二醛均购自中国阿拉丁试剂公司；ＮＮＡＬ、ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ、ＮＮＡＬ-ｄ3均购自加拿大ＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ公司。
1．2有机-硅胶杂化整体柱基质的制备及表征
毛细管预处理：为了提高整体材料在毛细管内壁上的聚合程度，预先使用盐酸溶液（1ｍｏｌ／Ｌ）、水、氢氧化钠溶液（1ｍｏｌ／Ｌ）和甲醇依次处理毛细管，最后使用氮气将毛细管吹干备用。
有机-硅胶杂化整体柱基质的制备：将5.0ｍＬ醋酸溶液（0.01ｍｏｌ／Ｌ）、800ｍｇ尿素、540ｍｇＰＥＧ（Ｍｒ10000）、1.8ｍＬＴＭＯＳ和0.5ｍＬγ-ＭＡＰＳ加入圆底烧瓶中，涡流搅拌2ｍｉｎ至澄清后，在0℃水浴条件下磁力搅拌水解2.5ｈ，形成均匀透明的混合液。之后将1ｍｇＡＩＢＮ及15ｍｇＡＡＭ加入0.5ｍＬ上述混合液，经30ｍｉｎ超声脱气并混合均匀后，将聚合液灌入预先经酸碱处理过的毛细管中，两端用硅胶塞封闭，置于40℃水浴中反应16-20ｈ。结束后，利用乙腈及高纯水洗去毛细管内残留的ＰＥＧ和其他未反应的有机物，得到ＡＡＭ整体柱。使用光学显微镜及扫描电镜对制备的整体柱内部结构进行表征。
1．3固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备
采用戊二醛交联法将β-葡萄糖醛酸酶共价键合到ＡＡＭ整体柱基质上。具体制备过程如下。
（1）将体积分数为10％的戊二醛水溶液连续通入有机-硅胶杂化整体柱1.5ｈ；然后采用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，磷酸根离子浓度为0.05ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ7.0）洗去残余的戊二醛，制得接有戊二醛的有机-硅胶杂化整体柱。
（2）在4℃下将含有2500Ｕ／ｍＬ的β-葡萄糖醛酸酶溶液（0.05ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｐＨ7.0，含有5ｍｇ／ｍＬ的氰基硼氢化钠）循环通入步骤（1）制得的20ｃｍ整体柱中24ｈ；用ＰＢＳ将未键合的β-葡萄糖醛酸酶冲出，制得固定化的β-葡萄糖醛酸酶反应器；最后，在制备好的酶反应器中注入Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ缓冲液（0.05ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ7.1），于4℃下保存备用。
1．4ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ标准品的酶解及分析
采用0.05ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液制备不同质量浓度的ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ标准溶液：100、50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05ｎｇ／ｍＬ。在室温条件下，以0.3μＬ／ｍｉｎ的流速将30μＬ标准溶液通入固定化酶反应器进行酶解，收集酶解产物，并将2ｎｇ（100ｎｇ／ｍＬ）的内标溶液加入酶解产物中，经真空冻干，利用0.1％（ｖ／ｖ）甲酸水溶液进行复溶，最后经ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ分析。
色谱柱：ＷａｔｅｒｓＣ18Ｓｉｌｉｃａ柱（100ｍｍ×3.0ｍｍ，300μｍ），柱温30℃；进样量：5μＬ；流速：0.3ｍＬ／ｍｉｎ；流动相Ａ：0.1％（ｖ／ｖ）甲酸水溶液，Ｂ：0.1％（ｖ／ｖ）甲酸甲醇溶液。洗脱梯度如下：0~3ｍｉｎ，50％Ｂ~90％Ｂ；3~4ｍｉｎ，90％Ｂ~100％Ｂ；4~5ｍｉｎ，100％Ｂ；5.0~5.5ｍｉｎ，100％Ｂ~50％Ｂ；5.5~6.0ｍｉｎ，50％Ｂ。离子源：电喷雾离子（ＥＳＩ）源；扫描模式：正离子模式；监测方式：多反应监测（ＭＲＭ）；电喷雾电压：4000Ｖ；离子源温度（ＴＥＭ）：390℃。表1列出了底物、酶解产物及内标物的多反应监测参数。
1．5ＮＮＡＬ标准工作曲线的绘制
利用0.05ｍｏｌ／ＬＰＢＳ制备ＮＮＡＬ标准溶液，质量浓度分别为100、50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05ｎｇ／ｍＬ；以及100ｎｇ／ｍＬ的ＮＮＡＬ-ｄ3标准溶液。将5ｎｇ（100ｎｇ／ｍＬ）ＮＮＡＬ-ｄ3分别加入1ｍＬＮＮＡＬ标准溶液中。以ＮＮＡＬ的色谱峰面积与内标物ＮＮＡＬ-ｄ3峰面积之比对目标物与内标物质量浓度之比进行线性回归分析，得到标准工作曲线及相关系数（Ｒ2）。
1．6酶反应器酶解检出限的测定
分别取100、50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05ｎｇ／ｍＬ的ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ标准溶液30μＬ进行水解。向不同质量浓度的酶解产物中加入2ｎｇ（100ｎｇ／ｍＬ）内标ＮＮＡＬ-ｄ3，按照上述1.4节方法进行酶解与液相色谱-质谱分析，将信噪比Ｓ／Ｎ=3时产物ＮＮＡＬ的峰面积与内标ＮＮＡＬ-ｄ3的峰面积比值代入ＮＮＡＬ标准工作曲线，获得固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的检出限。
1．7酶反应器酶活性的测定
以对硝基酚-β-Ｄ-醛酸苷作为酶反应器底物，利用紫外吸收光谱法检测酶解产物对硝基酚，以测定β-葡糖糖醛酸酶反应器的酶活性，检测波长为405ｎｍ。
对硝基酚标准工作曲线的绘制：称取1.3911ｇ对硝基苯酚，用50ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ定容至100ｍＬ，获得100ｍｍｏｌ／Ｌ的对硝基苯酚标准溶液，利用此溶液配制1ｍｍｏｌ／Ｌ对硝基苯酚溶液。采用50ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ将上述溶液配制成10~500μｍｏｌ／Ｌ的对硝基酚系列标准溶液，绘制对硝基酚标准曲线，空白对照样品为50ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ。
底物溶液的配制：称取25ｍｇ的对硝基酚-β-Ｄ-葡萄糖醛酸苷，利用50ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ定容至50ｍＬ，其浓度为3.60ｍｍｏｌ／ｍＬ。
β-葡萄糖醛酸酶反应器酶活性的测定：首先取30μＬ底物溶液，使用注射泵以0.3μＬ／ｍｉｎ的流速通入β-葡萄糖醛酸酶反应器，接取流穿液。其次，将30μＬ50ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ以相同流速通入固定化酶反应器中，接取流穿液作为空白。最后，使用紫外吸收光谱法测定样品的吸光度，进而计算对硝基酚的释放量（μｍｏｌ）。
1．8回收率的测定
在50ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ中加入ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ标准品，制备10ｎｇ／ｍＬ的标准溶液。取30μＬ，加入2ｎｇ的ＮＮＡＬ-ｄ3，采用β-葡萄糖醛酸酶反应器进行酶解与液相色谱-质谱分析。利用上述ＮＮＡＬ标准工作曲线计算同批次制备的酶反应器酶解产物ＮＮＡＬ的浓度。根据产物ＮＮＡＬ与底物ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ的浓度比值得到酶反应器的回收率。
2结果与讨论
2．1有机-硅胶杂化整体柱基质制备方法的优化及表征
如图1所示，“一锅法”制备有机-硅胶杂化整体柱基质分为两步，首先是γ-ＭＡＰＳ与ＴＭＯＳ的缩聚反应，其次是有机功能单体ＡＡＭ与预缩合硅氧烷的自由基聚合反应。制备整体柱的过程中，反应温度、反应时间、单体ＡＡＭ和致孔剂的用量等因素会影响基质的形貌、孔隙尺寸及通透性。
为了优化整体柱的制备条件，设计了4个优化实验。（1）保持尿素、ＴＭＯＳ及ＰＥＧ的用量不变，只改变γ-ＭＡＰＳ的用量，以考察硅烷试剂使用比例对整体柱基质材料通透性的影响。（2）保持尿素、ＴＭＯＳ及γ-ＭＡＰＳ的用量不变，改变致孔剂ＰＥＧ的用量，以考察致孔剂对整体柱基质材料通透性的影响。（3）保持其他条件不变，改变有机功能单体ＡＡＭ的用量，以考察其对整体柱基质材料通透性的影响。为避免ＴＭＯＳ和γ-ＭＡＰＳ在缩聚反应过程中直接与ＡＡＭ聚合，在灌入毛细管之前，将其醋酸溶液放置在冰水浴（0℃）中。以上优化过程中聚合反应温度统一为40℃。（4）保持其他条件不变，改变自由基聚合反应温度，考察其对整体柱基质材料通透性的影响。
具体实验条件及每种条件下毛细管整体柱的光学成像结果如表2所示。
硅烷试剂比例过高或过低对整体柱的渗透性均有影响［17，18］。通过控制γ-ＭＡＰＳ用量可调控反应体的相分离溶胶-凝胶过程，从而改变固定相的骨架结构。在表2的Ｂ、Ｄ、Ｅ实验中，ＴＭＯＳ与γ-ＭＡＰＳ的配比分别为18:5、18:3、18:7（ｖ／ｖ）。从光学显微镜表征图像中可以看出，当γ-ＭＡＰＳ的用量较少时，整体柱基质呈现半透明状态，渗透性差（Ｄ）；而γ-ＭＡＰＳ量较多时，虽然整体柱基质均匀，但结构密实，通透性较差（Ｅ）；相比之下，当两种单体的体积比为18:5时（Ｂ），整体柱基质材料均匀，且通透性良好。
选择适当的致孔剂用量有助于改善整体柱的渗透性［17］。在实验中控制尿素与ＴＭＯＳ的用量为800ｍｇ和1.8ｍＬ，改变ＰＥＧ的用量，结果如表2中Ａ、Ｂ和Ｃ所示。通过比较可以看出，Ａ实验参数条件下，整体柱基质未完全聚合，机械强度较差。当ＰＥＧ用量为540ｍｇ时（Ｂ），整体柱表现出更好的通透性，与Ａ、Ｃ相比也更加均匀。
在整体柱制备反应中，控制自由基聚合反应温度可调节整体柱基质材料孔隙的大小。当澄清透明的预聚液在较低水浴温度下反应16~20ｈ后，其整体柱基质通透性好，但孔隙大，结构疏松并且干燥的基质与毛细管内壁有轻微的脱壁现象（Ｈ）。聚合反应温度过高时，整体柱基质呈现半透明状，渗透性差（Ｉ）。自由基聚合反应水浴温度为40℃时，整体柱基质材料空隙均匀，通透性良好，机械强度高（Ｂ）。
通过Ｂ、Ｆ和Ｇ实验考察了15、10和30ｍｇＡＡＭ对于整体柱形貌的影响。结果显示，ＡＡＭ用量较多时（Ｇ），整体柱基质材料呈半透明状态且通透性差；减少ＡＡＭ用量，渗透性大为改善，但干燥的整体柱基质在毛细管内出现裂痕（Ｆ）。图2为条件Ｂ下的扫描电镜表征结果，可以看到，整体柱内部孔隙均匀，与毛细管内壁结合牢固，未出现脱壁现象。该条件下的整体柱结构最为理想，将其作为最优实验条件用于以下所有实验。
2．2固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备及优化
2．2．1戊二醛体积分数的优化
戊二醛作为常用的交联剂，其体积分数对固定化酶反应器水解效果影响较大［19］。因此对其进行了优化。分别将体积分数为1％、5％、10％、25％的戊二醛水溶液连续通过有机-硅胶杂化整体柱1.5ｈ，之后修饰β-葡萄糖醛酸酶，制备酶反应器。酶反应器水解质谱图如图3所示。不同条件下，ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ均发生水解，说明所制备的β-葡萄糖醛酸酶反应器均具有一定的反应活性。但从图4结果发现，不同戊二醛体积分数条件下，酶解产物与残留底物的峰面积比值存在明显不同。戊二醛为10％时最高，说明此时的酶解效果最好。这可能是由于戊二醛体积分数过低时，酶的键合量偏少，底物水解不完全；而体积分数过高时，对酶活性有一定的抑制作用，导致底物水解不完全。因此，戊二醛的最优体积分数为10％。
2．2．2水解流速的选择
水解流速不同会使水解效率产生差异，因此将水解流速分别设定为0.2、0.3和0.4μＬ／ｍｉｎ，考察不同流速条件对底物水解效率的影响。利用注射泵将30μＬ0.1ｍｇ／ｍＬ的底物通入酶反应器，收集流穿液进行ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ分析。通过比较各个流速下底物的酶解情况，选择最适流速。结果如图5所示，各个流速下固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器对底物均有一定的酶解效果，其中酶解产物与残留底物的峰面积比值在0.3μＬ／ｍｉｎ时最高。这主要是由于随着流速增大，底物在酶反应器内的湍流加剧，扩散速度增加，从而有利于提高酶解效率，但是当流速过大时，底物与酶的接触时间减小，导致酶切效率降低［20］。因此，将流速设定为0.3μＬ／ｍｉｎ。
2．3固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的性能评价
2．3．1水解性能的评价
由2.2.1和2.2.2节的结果可以看到，所制备的酶反应器在室温条件下对ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ具有较好的酶解效果，而且整个水解与液相色谱-质谱分析可以在2ｈ内完成（而自由溶液水解需要24ｈ）。对比分析酶解产物中ｍ／ｚ210.1的二级质谱图，并与标准品ＮＮＡＬ的二级质谱图进行对比。如图6所示，酶解产物的ＭＳ／ＭＳ谱图中均含有ＮＮＡＬ特征碎片离子：ｍ／ｚ93.0、122.0和180.1，该结果进一步验证了固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的有效性。
2．3．2检出限
利用内标法得到ＮＮＡＬ的标准工作曲线ｙ=57.284ｘ+0.5669（Ｒ2=0.9997），其中ｘ为ＮＮＡＬ与ＮＮＡＬ-ｄ3的质量浓度比，ｙ为ＮＮＡＬ和ＮＮＡＬ-ｄ3的色谱峰面积比。ＮＮＡＬ标准品在0.05~100ｎｇ／ｍＬ的浓度范围内线性良好。基于该工作曲线计算得到固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的酶解检出限为0.28ｎｇ／ｍＬ。Ｄｅｌｓｈａｎｅｅ等［21］利用β-葡萄糖醛酸酶对吸烟者的尿样进行酶解分析，得到吸烟者尿液内总ＮＮＡＬ的平均水平在0.336ｎｇ／ｍＬ左右。该结果与本固定化酶反应器检出限相当，说明我们制备的固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器有望用于复杂样品中目标物的分析。
2．3．3回收率
为得到固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器对底物的回收率，在10ｎｇ／ｍＬ的30μＬ底物样品中加入2ｎｇ内标物ＮＮＡＬ-ｄ3，按照上述优化后的实验条件进行酶解和分析，计算回收率为87.52％。该结果与周廉淇等［22］利用原子转移自由基聚合修饰银丝制备的固定化胰酶反应器的回收率（87.67％）接近，证明该固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器具有较好的回收率。
2．3．4酶活性的测定
β-葡萄糖醛酸酶的一个酶活性单位（1Ｕ）［23］定义为，在ｐＨ7.0及一定酶解温度下，每小时对硝基酚-β-Ｄ-葡萄糖醛酸苷释放1μｍｏｌ对硝基酚所需酶量。酶活性计算公式如下：酶活性（Ｕ／Ｌ）=对硝基酚释放量（μｍｏｌ）／反应时间（ｈ）／被检测液量（Ｌ）。在10-500μｍｏｌ／Ｌ的浓度范围内，对硝基酚浓度与吸光度值呈正比例关系，对硝基酚标准曲线方程为：ｙ=0.0059ｘ-0.0152（Ｒ2=0.9998），其中ｘ为溶液浓度（μｍｏｌ／Ｌ），ｙ为吸光度。将质量浓度为0.5ｍｇ／ｍＬ的底物溶液通过酶反应器，收集洗脱液，以ＰＢＳ作为空白对照，产物的吸光度值为2.489。通过标准曲线确定产物对硝基酚的浓度为424.47μｍｏｌ／Ｌ。经过计算得知β-葡萄糖醛酸酶反应器的酶活性为707.45Ｕ／Ｌ。
3结论
本文制备了一种新型的有机-硅胶杂化整体柱基质，发展了可用于水解ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ的β-葡萄糖醛酸酶反应器，实现了ＮＮＡＬ-Ｏ-Ｇｌｕｃ的快速高效水解，检出限0.28ｎｇ／ｍＬ，回收率87.52％。后期将进一步优化液相色谱-质谱实验条件，以降低β-葡萄糖醛酸酶反应器的检出限，并将发展的酶反应器应用于尿液、血浆样品体系，为实现体液内烟气代谢产物的高效水解与分析提供可靠方法。
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