摘要：葡萄糖氧化酶(Ec1．1．3．4)作为一种高特异性氧化还原酶，能够催化口．D葡萄糖转化为葡萄糖酸，并产生过氧化氢(H：0：)，在医疗检测、食品、生物燃料电池、畜牧养殖等领域发挥着极其重要的作用。该文从微生物来源、克隆表达、发酵优化、分离纯化及应用方面，阐述了葡萄糖氧化酶的研究进展，以期为葡萄糖氧化酶的开发和应用提供参考。
关键词：葡萄糖氧化酶,微生物,克隆表达,分离纯化:应用
葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)EC1．1．3．4是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸(navineadeninedinucleotide，FAD)的二聚体蛋白酶，能够以分子氧为电子受体，特异性催化lIB．D葡萄糖转化为葡萄糖酸，并产生H：O：，具有广泛的应用价值[1】。GOD作为制造葡萄糖检测传感器的重要酶制剂【2】，在医疗领域和发酵工业应用较多。GOD作为食品添加剂，能够抑菌、延长商品货架期、防止食物褐变以及用于生产低酒精度红酒【3]。此外，GOD还可用于生产燃料电池和饲料添加剂，在能源领域和养殖业中有潜在应用价值M。GOD广泛存在于微生物及昆虫体内，前者因繁殖快、操作简单、成本低等优点，已成为GOD资源开发的主要来源M。本文介绍了GOD的微生物来源、分离纯化、发酵、克隆表达、应用方面的研究进展，并对研究前景进行了展望，旨在深入了解GOD，为其理论研究及生产应用提供参考。
1GOD的微生物来源
白黑曲霉(Aspe画Jjusn詹er)中的GOD首次被发现以来，研究者在多种微生物中检测到GOD，其中曲霉属(As．pe曙珊ussp．)、青霉属(Penjcmiumsp．)为GOD的主要来源。近年，在一些酵母和细菌中也发现GOD。随着高通量筛选技术的应用，相信会有更多产GOD菌株被发现。
1．1真菌来源
MuLLERD在1928年首次于黑曲霉(A．n垃。无细胞提取物中发现并命名了GOD；1936年又首次于灰绿青霉(PenjcⅢj啪幽uc啪)中发现GOD【12】。之后，大量产GOD的曲霉和青霉属真菌被发现。真菌因产酶量高，成为目前GOD研究的主要对象。2013年，FARIDMA等【13】首次从黑曲霉(A．力堙er)NRC中分离到GOD，将GOD生产推向海洋领域。2叭5年，KRJAAM等【14]从塔宾曲霉(Asperg珊usmb一抽g舶s曲CTM507中分离到GOD，该GOD在pH3～9的范围内酶活稳定，具有抗真菌活性，首次表明该GOD能够用于农业病原菌防治。2017年，YUIVARY等习检测了多株南极酵母，从中筛选到5株产GOD菌株，其中，G．gas梳us分泌的GOD酶活最高，催化效率达到1．4×10，mol／(L·s)；最适反应pH5．6；最适反应温度64℃，相比黑曲霉似．删、尼崎青霉(Pe力记删啪ama朋sa“ense)等来源的GOD在25～40℃条件下有更高的酶活，并且在4℃仍保留约10％的酶活，拓宽了GOD的低温真菌来源。
国内对GOD的系统研究始于20世纪70年代。葡萄糖氧化酶协作组从367株青霉和曲霉中筛选到GOD高产菌点青霉(Penjcj埘啪n0￡an删)AS3．3871，以蔗糖为碳源，NaN0，为氮源，振荡培养后经静置，酶活达到15～18U／mL。发酵液经弱酸性阳离子交换柱层析后浓缩，得到GOD酶制剂，用于处理蛋清，能够除去其中的葡萄糖，有效防止干蛋白片的褐变。2013年，朱运平等旧从全国120余份土样中筛选到高产GOD的黑曲霉∽．力增神1504，该菌株同时合成胞夕}GOD(55．08U／mL)和胞内GOD(80．58U／mL)，经紫夕h．亚硝酸钠复合诱变，获得遗传稳定性高的突变菌uNⅡ021，其胞外GOD酶活达到186．32u／mL。江南大学酶工程实验室长期从事GOD研究，从最初的菌株筛选，到黑曲霉(A．n垃神z．25的鲥基因异源表达于巴斯德毕赤酵母(眦邮fo商提高产量，再到对重组菌进行改造，于2015年使GOD酶活达到1634．7U／mL，为有史以来报道的最高值[18】。
1．2细菌来源
目前关于产GOD细菌的报道较少。2013年，雷湘南等从2835株细菌中初筛出490株产酸菌，后经发酵复筛出7株产GOD细菌。经鉴定，6株为杆菌，l株为球菌(见表1)[12．Ⅲ。其中4株分泌胞外GOD，有2株为苍白杆菌，苍白杆菌B2059酶活最高，为0．1779斗mol／mL。2014年，石漱钰等首次报道了产GOD的海洋假单胞杆菌(PseudomonasaeflJgillosa)，该菌株所产GOD酶活达5．51U／mL，最适催化温度20℃，为低温酶，最适反应pH7．0，在低温保鲜、食品低温加工中有潜在应用价值。
2GOD的克隆表达及发酵生产
2．1GOD的克隆表达
通常野生菌株GOD产量较低，发酵时伴随其他酶的分泌，增加了GOD的分离纯化难度，对GOD产业化造成了严重影响。随着分子生物学技术的发展，基因克隆和表达成为提高GOD产量的重要措施。目前，多种来源的GOD被克隆，并在酿酒酵母(Saccjl踟ycescere俯谊e)、毕赤酵母(P．pas幻m)、多形汉逊酵母(Ha力senuJapoJ脚ofpjla)以及青霉属(Pe耐cmi啪sp．)等宿主中成功表达。
1995年，GEISEN将黑曲霉(A．n垃曲的god基因插入pSK+3．Sma载体，导入纳地青霉(P．na姆oyense)ATCC66742后获得成功表达，GOD酶活得到提高。之后有研究发现[3]，霉菌在发酵过程中，菌丝会影响搅拌效果，导致菌体与发酵液接触不良，造成GOD产量低。继而酵母菌凭借蛋白产量高、产物与菌体易分离等优点成为深层发酵的最佳宿主吲。2003年，MALHERBEDF等将黑曲霉(A．n咖r)的90d基因成功表达于酿酒酵母(S．cerevjs函e)，并研究了GOD在低酒精度红酒生产中的应用。过去几十年，酿酒酵母(1s．cere访s函e)被认为是GOD异源表达的有效体系，但最近研究发现，以s．cere协扬e为表达系统，会引起重组GOD的高糖基化表达。毕赤酵母(P．pasfD凼)系统可有效表达蛋白，而不会导致GOD的过度糖基化，已成为应用最广泛的表达系统之一。2014年，GAOzW等首先克隆了点青霉(P-no￡amm)F4的90d基因，根据毕赤酵母(P．pasfo—s)密码子偏好优化基因，然后插入pPIC9载体，并导入毕赤酵母①pas幻鳓GSll5表达，发酵后，GOD酶活达到615U／mL，蛋白质量浓度达2．5g／L，超过发酵液上清中总蛋白浓度的80％。2017年，陈楠等闭将黑曲霉(A．n坦er)PCTC的god基因插入具有AOxl强启动子的pPICz仪A表达载体，后导入毕赤酵母(PIpas幻m)SMDll68，经筛选、产酶条件优化，最高酶活达到32U／mL。
2．2GOD的发酵优化
GOD可由固态或深层发酵法生产，其发酵研究有近30年阿的历史。虽然大量菌株可合成GOD，但因低产量问题无法直接用于工业生产。发酵优化是提高酶产量的重要方式，随着专业软件的发展，GOD发酵优化从传统的单因素优化法逐渐发展到统计优化法。20叭年，KoNARP等[冽对黑曲霉．n螬珈进行GOD发酵优化，以玉米浆为唯一营养物质，使GOD酶活从(580±30)u／mL提高至(850±45)U／mL。2016年，郭云瑕等[冽对紫外诱变后的黑曲霉进行单因素发酵条件优化，以5％接种量，在30℃、160r／min条件下发酵72h，酶活达到优化前的9．56倍。2013年，FARJDMA等[1q对海洋黑曲霉(A．力堙er)NRC9进行GOD发酵培养基优化，首先利用单因素设计，筛选出对GOD发酵最为重要的4个因素：葡萄糖、caCO，、(NH4)：HPO。和MgS04，之后利用部分析因设计和响应面法，确定最适发酵培养基。经过发酵优化，酶活从(109．8l±1．38)U／mL提高至(170±O．88)u／mL。
大量研究结果表明跚，在GOD发酵生产中，碳源是主要的诱导剂，最适碳源通常是葡萄糖、蔗糖或糖浆，在发酵过程中控制高碳氮比通常会得到更高的GOD产量。caCO，也为发酵所必需，可诱导GOD合成，防止发酵过程中pH降低、提高GOD产量。此外，Fe2+、znz÷等金属离子也可作为诱导剂诱导GOD的产生【引]。而GOD生产过程中，H20：会抑制GOD的合成。
3GOD的分离纯化
为研究酶的结构和功能以及推动商品化，20世纪40年代即开始对GOD的纯化。GOD分子质量为130～175l(u，其纯化过程应用到了沉淀法、超滤、层析法【32】。1964年，PAzURJH等【33J通过硫酸铵盐析、DEAE一纤维素层析纯化到黑曲霉∽．n垃er)GOD，研究了该酶对不同底物的催化速率，对不同能力做了解释。近年，超滤因不会对酶造成破坏，酶回收率高等优点受到重视。绳状青霉(P．舢1记uJos啪)46分泌两种GOD，SEMASHKOTV等嗍开发了一种超滤膜分离法对两种GOD进行纯化。发酵液离心后经0．2¨m尼龙膜过滤，分别使用截留分子质量为100l(u、50l(u和20ku的超滤膜超滤，最终GOD浓度占起始浓度的90％，比活914～956IU，纯化效果理想。目前国内生产的GOD存在严重的纯度不高问题，使用的GOD主要依赖于进口，价格昂贵，GOD的纯化仍是我国未来研究的重点。
4GOD的应用
20世纪40年代国外开始出现GOD产品，到70年代对GOD的应用已十分普遍。我国紧跟市场需求，1960年，河南省轻化工业厅研究设计院将GOD应用于蛋品加工，1966年，中科院微生物研究所将筛选的GOD优良菌株投入生产，用于干蛋白片加工、尿糖试纸生产及实验室分析。1999年，GOD被我国农业部列入允许使用的饲料添加剂，用于维持畜禽肠道菌群、抑制霉菌生长、降解毒素等【3习。进入21世纪后，随着个体化医疗的加快，使得葡萄糖检测传感器成为研究热点。现今，传感器生产已成为GOD应用研究的主要领域，国内外研究数量显示，我国在该方面取得丰硕成果。
4．1在医药行业中的应用
糖尿病是世界第三大疾病，血糖的检测是病情护理的重要部分。从1962年首次提出GOD电极概念至今，GOD传感器已发展至第三代，成为检测葡萄糖的主要工具口q。GOD传感器以GOD特异催化葡萄糖为基础，通过检测GOD上电子的变化来测定溶液中葡萄糖浓度，也可通过荧光检测GOD分子中黄素腺嘌呤二核苷酸(naviIladeninedmucleotide，FAD)的变化来作用。何顺珍等∞利用GOD与罗丹明6G建立了一种测定恒量葡萄糖的新型荧光猝灭法，用于血糖测定，操作简便，结果可靠。近年，多种纳米材料被用于固定GOD以改善传感器功能。wUC等p目研制出一种纳米多孔金固定化的GOD电极，对葡萄糖有很高的敏感性，对胆固醇，三丁酸甘油酯、抗坏血酸等有很强的抗干扰能力，使用寿命长，用于人血清葡萄糖检测，结果与全自动分析仪一致。另外，GOD催化产生的葡萄糖酸可用于生产葡萄糖酸盐类保健品。
4．2在食品行业中的应用
传统食品加工中通常使用化学添加剂保持食品新鲜、延长货架期，但其使用不当会对人体造成危害。GOD作为食品添加剂，能够分解葡萄糖，防止食品氧化并有抑菌作用。1998年，VEMULAPALLIV等【39]将GOD加入面团，发现产生的H：0：使面团更有弹性，黏性更大，开创了GOD作为食品添加剂的应用。vALENC认PL等【柏】在红酒酿造中使用GOD／过氧化氢酶(catalase，cAT)酶系统，降低了葡萄糖的浓度，生产出低酒精度红酒，抑制了腐败菌的生长。食物中添加GOD，还可防止美拉德反应的发生，避免食物褐化和保持食品风味。此外，南美白对虾经GOD处理后于4℃贮藏120h，色泽、气味、咀嚼性、弹性等品质指标都显著优于对照组141】，表明GOD有一定的保鲜作用。
4．3开发生物燃料
能源危机和环境污染问题日益严重，使得以酶为主体的燃料电池开发受到广泛关注。GOD用于生物燃料生产已取得卓越成果。邹琼等【42]利用E．TEKPt／C阴极和新型燃料电池阳极(GoD／CNTs．B．CD．Fc／GC)构建了燃料电池，最大功率密度(33“、Ⅳ／cm，0．18V)，连续工作9h，仍有92％开路电位，稳定性好，为燃料电池设计提供了新思路。
4．4在其他方面的应用
在其他方面，GOD也发挥着重要作用。作为饲料添加剂，具有除氧、产酸、排除毒素、抑菌和维持肠道微生态平衡等独特作用【43】。我国在这方面研究较多，取得了丰硕成果。侯振平等M在断奶仔猪饲料中添加180U／l(gGOD后，相比对照组，仔猪对干物质和粗蛋白的消化率显著提高，腹泻率显著降低，提高了仔猪生长性能。除此之外，GOD催化产生的H：O：可用于漂白织物。GOD具有很大的应用潜力，开发催化效率高、稳定性强的GOD在实际的应用中至关重要。
5展望
目前国内外报道的GOD酶活普遍较低，不利于工业化生产。海洋资源的开发，为寻找高活性GOD提供了新途径。研究人员也在不断努力优化发酵过程和纯化步骤，提高GOD的产量，降低生产成本。此外，随着生物和其他学科技术的发展，提高GOD的异源表达水平，对酶进行修饰改善活性，扩大GOD的应用领域，深入酶的应用机理研究也将是今后的发展方向。
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