【摘要】流感病毒种类多、变异快，是对人类健康威胁最大的呼吸道病毒。季节性流感每年均会造成地区性疫情，大流行流感每隔几年导致全球性的流感大暴发，高致病性禽流感病情凶险，死亡率高。而流感病毒极高的基因重配效率严重影响了流感疫苗的效果。因此，抗流感药物成为流感疫情防控的核心手段。随着金刚烷胺、金刚乙胺的长期使用和作为动物饲料添加剂，季节性流感和新发流感病毒对其几乎全部耐药，而随着奥司他韦的广泛使用，流感病毒对神经氨酸酶抑制剂耐药也存在潜在的趋势，加快推进新型抗流感药物研发迫在眉睫。本文从流感病毒感染复制周期入手，对近年来抗流感药物新靶点、新药物实体进行综述，并重点阐述处于临床研究阶段的抗流感新药品种。
【关键词】流感病毒，抗病毒药物，小分子，临床研究
流感病毒(influenza virus)属于正黏病毒科(orthomyxoviridae)成员，分为甲型流感(influenza virusA，IVA)、乙型流感(influenza virus B，IVB)、丙型流感(influenza virus C，IVC)和丁型流感(influenza virus D，IVD)4种类型。甲型流感病毒除感染人外，在动物中广泛存在，如禽类、猪、马、海豹以及鲸鱼和水貂等；乙型流感病毒在人体内循环并引起季节性流行，在海豹中也有分离记载；丙型流感病毒可感染人类、猪和狗，但感染后症状轻微。丁型流感病毒主要感染牛。甲型流感和乙型流感是人类流感的主要病原体。甲、乙型流感病毒的基因组为负链RNA，分为HA、NA、M、NP、PBl、PB2、PA、NS 8个节段。结构蛋白HA、NA和M2蛋白嵌合在病毒包膜上，M1基质蛋白位于病毒包膜以下，病毒核心是由NP蛋白包裹病毒基因组RNA构成的核蛋白体。
流感病毒是呼吸道传播病毒，具有极高的基因重配以及基因突变频率。季节性流感的局部流行、高致病性禽流感的出现以及大流行流感的暴发对世界公共卫生体系构成巨大威胁。据世界卫生组织(WHO)估算，每年全世界季节性流感导致3 000 000～5 000 000例重症病例，290 000--650 000例死亡病例；自2003年以来，H5N1型禽流感已造成数百万例禽类感染，数百例人类死亡病例；2013年以来的HTN9疫情造成超过1 500例感染；2009～2010年的甲型H1N1流感大流行横扫全球214个国家和地区，造成18 449例死亡。
鉴于流感的巨大威胁，针对流感的抗病毒药物研发成为一直以来的研究热点，神经氨酸酶抑制剂奥司他韦、帕拉米韦等基于结构的药物设计取得了巨大成功。然而，随着流感病毒的变异，已有的抗流感药物面临严峻的耐药形势。由于季节性流感中已出现广泛的M2离子通道耐药位点，目前WHO已不推荐烷胺类药物用于季节性流感的临床治疗。2009年流感大流行分离株、2013年H7N9禽流感分离株中也相继发现奥司他韦耐药位点，说明该类药物的耐药趋势值得关注。本文将以流感病毒的感染复制周期为切人点，综述目前抗流感药物的研究进展。
1流感病毒的感染复制周期及药物概览
流感病毒的感染复制周期主要包括：吸附、内吞、膜融合、基因组复制、蛋白表达、组装出芽、释放等阶段。对宿主细胞的吸附是流感病毒启动感染的第一步。细胞表面蛋白的唾液酸是流感病毒的主要受体。人类呼吸道上皮细胞表面的唾液酸主要为α-2,6糖苷键，而禽类呼吸道上皮细胞主要为α-2，3糖苷键，一般认为这种唾液酸构型之间的差异是决定人类流感病毒和禽流感病毒不同宿主嗜性的主要因素。然而这种差异并不绝对，研究发现，人类呼吸道上皮细胞同样存在少量的α2-，3唾液酸，这是部分禽流感病毒能够感染人的因素之一。病毒HA蛋白的单点突变即可改变对不同唾液酸构型的结合能力，进而改变病毒嗜性。一旦结合到细胞之上，流感病毒通过4种机制完成内吞过程：网格蛋白依赖的内吞，小窝蛋白依赖的内吞，非网格蛋白／小窝蛋白依赖的内吞以及胞吞。一般认为网格蛋白依赖的内吞途径是流感病毒的主要内吞途径降”。
内吞之后，病毒表面的HA0被宿主蛋白酶切割为HAl和HA2。在酸性的内吞体环境中，HA变构之后暴露出HA2 N端的融合肽。最后融合肽插入到细胞膜中，触发膜融合过程。与此同时，病毒表面的M2离子通道将内吞体中的H+泵入病毒内部，诱发病毒内部结构的解体(例如NP和M蛋白的解聚)，暴露出游离的核糖核蛋白复合体(vRNP)。当膜融合过程完成后，vRNP进入细胞质，并转运至细胞核中，完成基因组复制和转录。PA、PBl和PB2组成流感病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RNA—dependent RNApolymerase，RdRp)。RdRp以vRNA为模板转录出mRNA和cRNA，进一步以cRNA为大量复制vRNA。病毒的出芽依赖NA的神经氨酸酶功能，NA负责切断HA和唾液酸之间的连接，使病毒颗粒释放。NA的另一项功能是负责切掉病毒表面的糖蛋白，防止病毒颗粒的聚集。
流感病毒感染复制的每一步都有病毒自身编码的蛋白和和宿主细胞蛋白参与。目前，针对流感病毒感染复制周期的各个阶段都有药物研发报道(图1)。
目前，全球经过各国药品管理部门批准上市的抗流感药物有4大类7个品种，分别为：M2离子通道抑制剂金刚烷胺(1966年，美国首先上市)和金刚乙胺(1993年，美国首先上市)，神经氨酸酶抑制剂扎那米韦(1999年，澳大利亚和美国首先上市)磷酸奥司他韦(1999年，瑞士首先上市，陆续在加拿大、欧洲、美国和中国上市)和帕拉米韦(2010年，韩国首先上市)，RNA聚合酶抑制剂法匹拉韦(2014年，日本首先批准)，血凝素HA抑制剂阿比多尔(1993年，俄罗斯上市)。
2靶向病毒吸附内吞阶段的抗流感抑制剂
病毒表面的HA是病毒吸附的主要功能蛋白，靶向HA的抗吸附抑制剂研发成为此类抑制剂研究的热点，抗体类药物的作用机制多为阻断病毒的吸附过程。硫酸右旋糖酐是较早发现的抗吸附抑制剂，其表面的负电荷能够抑制病毒颗粒和细胞表面的吸附，对HA和NA介导的吸附均有抑制活性。病毒的吸附涉及宿主表面的唾液酸，靶向宿唾液酸的抗病毒药物研究也取得了重要进展。DASl81(fludase)是该类药物的典型代表。DAS181是由两个功能域构成的大分子药物，一是肝素结合域，二是唾液酸酶域。该药物能够切除呼吸道表面的唾液酸分子，进而阻止流感病毒的吸附。该药物对H3N2，H7N9，H5N l，HlNl等流感亚型在体内和体外均具有良好的抗病毒活性，目前该药已经完成抗流感的Ⅱ期临床试验，并获得美国FDA突破性疗法认定。
吸附后的内吞过程需要多种宿主蛋白的参与，该类抑制剂的主要作用靶标为宿主蛋白。水飞蓟素(silymarin)能够作用于网格蛋白介导的内吞途径，进而抑制流感病毒吸附后的内吞。
3靶向病毒膜融合阶段的抗流感抑制剂
流感病毒膜融合主要由HA的变构介导，因此HA的变构抑制剂成为抗膜融合抑制剂的研究热点之一。BMY-27709能够有效抑制H1和H2亚型的流感病毒，其针对A型流感病毒的体外坛。介于3～8μM之间。除此之外，有研究发现stachyflin也可以抑制HA的变构，从而抑制流感病毒的复制。阿比多尔是前苏联研发的抗流感药物，其具有广谱抗病毒活性。研究表明，阿比多尔作用于HA的膜融合，以变构抑制剂的形式发挥抗流感活性。
流感病毒的膜融合依赖于内吞体酸化和宿主蛋白酶等一系列宿主酶类。萘莫司他、亮肽素、卡莫司他、抑肽酶等一系列蛋白酶被报道有抗流感病毒活性，其作用机制被认为是抑制宿主蛋白酶对HA0的切割。V-ATPase抑制剂如巴弗洛霉素Al等能够阻断氢离子进入内吞体，抑制内吞体的酸化，进而抑制酸性条件下HA所发生的变构，从而发挥抗病毒活性氯喹(chloroquine)能够通过调节宿主细胞pH从而抑制流感病毒的内吞过程。然而，一项氯喹预防流感的随机、双盲、对照临床试验显示，健康人群服用氯喹无法预防流感的发生。
4靶向病毒核酸释放的抗流感抑制剂
该类抑制剂的作用靶标主要为M2离子通道抑制剂。M2离子通道是最早成功的抗流感药物靶标，1960年代批准的金刚烷胺是经典的抗流感药物。经过多年的临床应用，目前金刚烷胺、金刚乙胺类化合物已经出现广泛的耐药性，WHO已不推荐其作为季节性流感的治疗药物。非烷胺类M2抑制剂成为目前研究的关注点之一，该类药物主要包括聚胺类化合物(如精胺、精脒)，螺哌啶及其衍生物，以及pinanamine等天然产物。
5靶向病毒核酸复制阶段的抗流感抑制剂
该类抑制剂主要分为4类：PB2帽子结合区域抑制剂，核苷类似物，PA核酸内切酶抑制剂，干扰RdRp复合体组装的抑制剂。PB2帽子结合区抑制剂是近年来抗流感抑制剂研究的热点，其典型代表是VX787。该类化合物对甲型流感的主要亚型以及奥司他韦耐药株均有良好的体外及体内抗病毒活性，其IC50低至纳摩尔级。体内试验结果显示，感染后96h给药依然能达到100％的保护效果。Ⅱ期临床结果显示，VX-787可以显著降低病毒数量以及流感样症状的严重程度和持续时间。
以法匹拉韦(favipiravir，T-705)为代表的核苷类似物由于具有广谱抗病毒活性，一直以来是抗流感药物研发的重点。法匹拉韦是有日本富士公司研发的广谱抗病毒药物，2014年完成治疗流感的Ⅲ期临床试验，被日本厚生劳动省批准作为抗流感药物上市。该药物对丝状病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、披膜病毒科等烈性RNA病毒科成员以及正黏病毒科、副黏病毒科、小RNA病毒科、黄病毒科等非烈性RNA病毒科成员在体外及体内均具有良好的抑制效果。临床试验结果显示，法匹拉韦能够有效缩短流感病程时间，降低病毒载量。
除此之外，PA核酸内切酶抑制剂以及干扰RdRp复合体组装的抑制剂也有文献报道，L一735822、flutimide为核酸内切酶抑制剂的代表性抑制剂。
6靶向病毒蛋白翻译和组装的抗流感抑制剂
硝唑尼特是目前抗流感药物研究的热点药物。该药是第一个噻唑类抗感染药物，可抑制包括神经氨酸酶抑制剂耐药的病毒株在内的多种类型流感病毒的复制，阻断翻译后阶段病毒血凝素的成熟。细胞培养研究发现，硝唑尼特可与神经氨酸酶抑制剂发生协同效应；还可抑制呼吸道病毒的复制，如副流感病毒、冠状病毒以及呼吸道合胞病毒。目前已经完成该药的Ⅲ期临床试验，研究结果显示，硝唑尼特可减少急性无合并症流感患者的症状持续时间。
核抑素能够引起NP蛋白的聚集，阻碍该蛋白向细胞核内的转运，对H1N1，H3N2以及H5N1均有良好抗病毒活性；放线菌酮和萘普生能够阻止NP蛋白的多聚化卅；Ingavirin能够直接干扰NP蛋白的核转运，进而发挥抗流感活性。
7靶向病毒释放的抗流感抑制剂
病毒出芽后，需借助自身编码的NA切断病毒蛋白和宿主细胞表面唾液酸之间的连接。目前，该类抗流感药物上市品种最多，包括奥司他韦、帕拉米韦、扎那米韦、拉尼米韦等。
与M2离子通道抑制剂的机制不同，NA抑制剂对M2离子通道抑制剂耐药株均有效，因此是继烷胺类药物之后的主流抗流感药物。扎那米韦是美国FDA批准的首个NA抑制剂，剂型为吸人剂；奥司他韦1999年被FDA批准上市，口服给药，是目前市场上的一线抗流感药物；帕拉米韦目前在中国、日本已经获批，给药方式为静脉注射，主要用于重症流感的救治；拉尼米韦在日本获批，剂型为吸入剂，有研究显示其对奥司他韦耐药株有效。目前NA抑制剂类药物的主要研究重点是在奥司他韦和tkN米韦的基础上进行进一步改造，以克服愈演愈烈的耐药问题。
NA是流感病毒特有的酶，宿主细胞中没有类似的酶类，较低的毒性风险使得该酶一直是抗流感药物研发的热点靶标。目前对NA抑制剂的研究方向主要有新母核抑制剂筛选及衍生，共价抑制剂研究，以及多价抑制剂研究。但目前为止，未有推进到临床阶段的新抑制剂报道。
8结语
流感病毒变异快、危害大，是一直以来最受关注的病毒。抗流感药物的研发因此成为抗病毒药物研发领域的热点。虽然目前抗流感药物上市品种最多，但随着各个一线药物耐药形势的恶化，对新型抗流感药物的需求也更加迫切。值得欣慰的是，随着法匹拉韦、硝唑尼特、VX787等品种的陆续上市，一线药物的耐药威胁有望在近年内得到缓解。但面对流感病毒的快速变异，新的耐药株也将逐步出现，因此加强抗流感新机制、新品种研究，形成稳定的品种梯队，才能更加有效的对未来流感疫情进行防控。
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